本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因Rv3136影響胞壁重塑及其分子機(jī)理

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌被認(rèn)為是較成功和廣泛分布的胞內(nèi)病原菌之一,將近有三分之一的世界人口感染,每年死亡人數(shù)高達(dá)150萬。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)最新公布的《2015年全球結(jié)核病報(bào)告》統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,2014年結(jié)核病在全球范圍奪去了150萬人的生命,其中110萬為HIV陰性患者,40萬是HIV陽性的結(jié)核病患者。在2014年,WHO估算全球新發(fā)結(jié)核病例是960萬,而這包括了約540萬男性、320萬女性以及100萬的兒童,更可怕的是12%的新發(fā)病例是HIV陽性患者。而這龐大的數(shù)據(jù)結(jié)果表明,我國依然是結(jié)核病高發(fā)國家,僅次于印度(220萬)和印度尼西亞(100萬)而位居全球第三位。而耐藥形勢(shì)依舊不容樂觀,2014年,WHO估算全球新發(fā)生48萬MDR-TB(Multidrug-resistant TB,MDR-TB)病例,其中只有約四分之一病例被檢測(cè)和報(bào)告。雖然有抗結(jié)核的新藥物及疫苗不斷出現(xiàn),但是隨著耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)以及與HIV的共感染,愈是加劇了預(yù)防和治療結(jié)核病的困難。結(jié)核分枝桿菌,這一古老的病原菌,有著獨(dú)特細(xì)胞壁,主要由脂質(zhì)類和糖類組成,為親水性藥物提供了一個(gè)滲透屏障,并對(duì)于其自身的存活和毒力有著重要的作用。這個(gè)大分子結(jié)構(gòu),即枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖,磷脂酰-肌紅蛋白-肌醇為基礎(chǔ)的脂聚糖,是分枝桿菌細(xì)胞壁的主要特點(diǎn)。這些細(xì)胞壁成分的組裝是過程是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物的潛在靶標(biāo)。而這些組成成分的生物合成過程中的調(diào)控通路同樣也是尋找新藥靶的潛在對(duì)象。結(jié)核分枝桿菌PPE(Pro-Pro-Glu)家族代表了一類獨(dú)特的分枝桿菌蛋白,有180個(gè)氨基酸組成的保守N末端,共有69個(gè)成員。目前報(bào)道的大部分PPE蛋白因?yàn)槠涮赜械腜PE結(jié)構(gòu)域,均亞細(xì)胞定位在細(xì)胞表面。盡管一些PPE蛋白被報(bào)道參與在宿主先天免疫作用或者對(duì)于細(xì)菌的毒力有著重要的關(guān)系,但是大部分的功能目前尚未闡明。其中家族成員PPE51(Rv3136)仍然是功能未知的蛋白。為了探索Rv3136基因在分枝桿菌中的所編碼蛋白的功能,在本研究中,我們以分枝桿菌非致病性快速生長型模式菌株—恥垢分枝桿菌為研究對(duì)象,異源表達(dá)了Rv3136基因獲得了重組恥垢分枝桿菌MS_Rv3136。本研究闡述了PPE家族成員PPE51(Rv3136)對(duì)分枝桿菌的細(xì)胞壁重塑的影響。通過實(shí)驗(yàn)研究證明,Rv3136不是分泌蛋白而是亞細(xì)胞定位在細(xì)菌細(xì)胞壁上。Rv3136基因能夠明顯的改變細(xì)菌菌落表型、滑動(dòng)能力以及生物膜的穩(wěn)定狀態(tài),暗示著該基因可能會(huì)與細(xì)胞壁的組成成分相關(guān)聯(lián)。在各種壓力環(huán)境(SDS、酸性環(huán)境、H2O2和聯(lián)胺)下,重組恥垢分枝桿菌MS_Rv3136均表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢(shì)。此外,當(dāng)把該重組菌暴露于胞壁相關(guān)的抗生素(異煙肼和萬古霉素)下的時(shí)候,其表現(xiàn)出耐受表型。溴化已錠攝入實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞壁的滲透性發(fā)生了改變。為了進(jìn)一步探索Rv3136是否因?yàn)橛绊懠?xì)胞壁成分的組成進(jìn)而增強(qiáng)分枝桿菌在體內(nèi)的存活率,我們將重組恥垢分枝桿菌感染人源巨噬細(xì)胞(THP-1),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rv3136同樣增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活力。之后我們檢測(cè)了該重組菌株中與胞壁成分相關(guān)的幾個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況,結(jié)果顯示過表達(dá)Rv3136基因后顯著上調(diào)了glfT2(MSMEG_6403),glfT1(MSMEG_6367),mptA(MSMEG_4241),mgtA(MSMEG_1113),ubiA(MSMEG_6401)和pimB(MSMEG_4253)以及sigF(MSMEG_1804)。這幾個(gè)基因分別是與細(xì)胞壁上組成成分有著重要關(guān)聯(lián)。綜上所述,我們所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PPE家族成員Rv3136蛋白可能與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分組成相關(guān),而這將為PPE家族蛋白添加新功能,同時(shí)也為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重塑機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PPE家族 細(xì)胞壁 Rv3136 胞內(nèi)存活
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 文獻(xiàn)綜述10-19
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的組成和特征11-12
• 1.2 合成結(jié)核菌細(xì)胞壁的基因及途徑12-16
• 1.2.1 分枝桿菌枝菌酸的合成12-13
• 1.2.2 分枝桿菌肽聚糖的合成13-14
• 1.2.3 分枝桿菌阿拉伯半乳聚糖的合成14
• 1.2.4 分枝桿菌磷脂酰甘露糖苷，脂甘露聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成14-16
• 1.2.5 細(xì)胞分裂過程中細(xì)胞壁的合成16
• 1.3 細(xì)胞壁合成的調(diào)控16-17
• 1.4 展望17-19
• 第2章 前言19-21
• 第3章 實(shí)驗(yàn)材料和方法21-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料21-24
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、載體和細(xì)胞21
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)用主要試劑21-22
• 3.1.3 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)試劑的配制22-23
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備23-24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法24-36
• 3.2.1 設(shè)計(jì)與合成引物24
• 3.2.2 目的基因的獲得24-25
• 3.2.3 目的基因Rv3136的TA克隆25
• 3.2.4 大腸桿菌DH5a、BL21和JM109感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化25-26
• 3.2.5 Rv3136重組蛋白的表達(dá)26-27
• 3.2.6 恥垢分枝桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化27-28
• 3.2.7 Western blot檢測(cè)重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)28-29
• 3.2.8 Rv3136（PPE51）重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的亞細(xì)胞定位分析29-30
• 3.2.9 重組恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)觀察30
• 3.2.10 恥垢分枝桿菌生物膜培養(yǎng)30
• 3.2.11 滑動(dòng)實(shí)驗(yàn)30
• 3.2.12 掃描電鏡觀察重組恥垢分枝桿菌菌體形態(tài)30-31
• 3.2.13 重組恥垢分枝桿菌在酸性條件下的存活影響31
• 3.2.14 重組恥垢分枝桿菌對(duì)SDS耐受性檢測(cè)31-32
• 3.2.15 重組恥垢分枝桿菌對(duì)氧化壓力的影響32
• 3.2.16 溴化已錠（EB）攝入實(shí)驗(yàn)32-33
• 3.2.17 重組恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞后胞內(nèi)存活率及細(xì)胞因子檢測(cè)33-34
• 3.2.18 Rv3136對(duì)胞壁相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響34-36
• 第4章 結(jié)果與分析36-50
• 4.1 RV3136在致病分枝桿菌中是保守蛋白36
• 4.2 RV3136目的基因擴(kuò)增和鑒定36-37
• 4.3 構(gòu)建大腸桿菌BL21-PET28-RV3136表達(dá)菌株37-38
• 4.4 RV3136重組蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)成功38
• 4.5 成功構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌MS_RV313638-39
• 4.6 RV3136定位在恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁上39-40
• 4.7 MS_RV3136菌落形態(tài)觀察和生物膜形成40-41
• 4.8 過表達(dá)RV3136基因?qū)u垢分枝桿菌滑動(dòng)能力的影響41
• 4.9 過表達(dá)RV3136基因?qū)u垢分枝桿菌菌體形態(tài)的影響41-42
• 4.10 過表達(dá)RV3136基因?qū)u垢分枝桿菌生長速率無顯著影響42
• 4.11 過表達(dá)RV3136基因增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在低PH環(huán)境下的存活能力42-43
• 4.12 過表達(dá)RV3136基因增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌對(duì)表面壓力（SDS）的耐受43-44
• 4.13 過表達(dá)RV3136基因增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)H2O2的耐受44
• 4.14 過表達(dá)RV3136基因增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)聯(lián)胺的耐受44-45
• 4.15 過表達(dá)RV3136基因增強(qiáng)恥垢分枝桿菌對(duì)異煙肼和萬古霉素的耐受45-46
• 4.16 過表達(dá)RV3136基因降低了恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁的滲透性46-47
• 4.17 過表達(dá)RV3136基因利于恥垢分枝桿菌在THP-1 中存活47
• 4.18 過表達(dá)RV3136基因?qū)奘杉?xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子沒有明顯改變47-48
• 4.19 RV3136基因可能通過影響胞壁相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而改變細(xì)胞壁重塑48-50
• 第5章 結(jié)論與展望50-53
• 5.1 結(jié)論與分析50-51
• 5.2 展望51-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-61
• 在學(xué)期間發(fā)表的文章61

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

2 湛W歐，

本文編號(hào)：1076795