發(fā)布時間：2017-10-12 03:20

  本文關鍵詞：BTBD7基因在磨牙牙根發(fā)育過程中的表達及其作用

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【摘要】：牙齒發(fā)育是一個連續(xù)而且復雜的過程。牙胚是研究牙齒發(fā)育的理想模型。牙齒發(fā)育包括牙冠發(fā)育、牙根發(fā)育和牙周組織的發(fā)育三個部分。其中牙根發(fā)育在牙齒發(fā)育中占有重要地位,是不可缺少的部分。目前研究牙根發(fā)育主要是研究牙根發(fā)育的初始階段,對牙根發(fā)育中期特別是牙根發(fā)育形成根分叉時相對較少。赫特維希上皮根鞘一般被認為是牙根發(fā)育的重要決定因素。而發(fā)育期根端復合體作為一個有功能的整體,其組織結構在牙齒發(fā)育中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Btbd7基因所表達的蛋白對關鍵器官如肺臟、唾液腺分支結構的發(fā)育至關重要。其作用主要是遏制鈣黏附蛋白,從而使細胞分散形成分支。如果Btbd7基因受到抑制,那么唾液腺的分支發(fā)育就會受到嚴重影響。Btbd7蛋白控制著唾液腺和肺臟生長的上皮細胞分支。Btbd7能夠抑制細胞之間的相互粘附,從而使器官發(fā)育形成分支。因此我們推測在牙根發(fā)育過程中,BTBD7基因是否也有表達,有的話那它的表達會如何影響牙根數(shù)目的發(fā)育?關于這方面的報道目前還沒有。為了確定Btbd7基因在牙的發(fā)育過程中是否有表達,如果有表達,那主要表達在什么部位,我們首先用免疫組化方法檢測了Btbd7基因在根端復合體中的表達位置。確定了其在上皮根鞘區(qū)域有明顯表達,且在磨牙形成根分叉時表達更明顯。為了進一步確定這種作用,我們提取了出生8天時的幼鼠上皮根鞘細胞,通過RT-PCR和Western blot檢測切牙和磨牙中Btbd7基因的表達,以明確Btbd7基因與多根牙形成的相關性。目的：研究在單根牙和多根牙牙齒發(fā)育過程Btbd7基因在上皮根鞘中的表達變化,以觀察Btbd7基因?qū)ρ例X發(fā)育過程中多根牙形成的影響,探討其在此過程中所起的作用。方法：1.選取出生后第5天、第8天、第11天、第15天和第19天的Wistar大鼠幼崽,脫頸處死后解剖出上下頜骨。然后分離解剖出其切牙及第一磨牙的牙胚。制作石蠟切片,然后進行蘇木精—伊紅染色,查看牙根在不同時期的發(fā)育情況。免疫組化分別檢測切牙和磨牙牙胚中Btbd7基因的時空表達及差異。2.取出生后8天的幼鼠3只,脫頸處死后剝出上下頜骨內(nèi)前牙和第一恒磨牙的牙胚組織。然后切下牙冠硬組織邊緣的部分組織,Ⅰ型膠原酶消化和胰蛋白酶消化,進行原代細胞培養(yǎng)。然后用差速消化法得到上皮根鞘細胞,這時上皮細胞較純。最后用CK14和Vimentin進行細胞鑒定。3.用RT-PCR方法檢測BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘細胞中mRNA的表達變化。4.用Western blot方法檢測BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘細胞中蛋白的表達變化結果：1.HE染色顯示幼鼠出生后第5天,磨牙牙冠發(fā)育接近完成,牙尖部分開始鈣化,在牙頸部區(qū)域形成的突出結構是頸環(huán),但此時沒有明顯的上皮根鞘結構,而牙根尚未開始發(fā)育；幼鼠出生后第8天,磨牙牙冠基本發(fā)育完成,牙根開始發(fā)育,頸環(huán)處內(nèi)釉上皮和外釉上皮開始增生,可見上皮根鞘結構；幼鼠出生后第11天,磨牙牙根區(qū)上皮根鞘繼續(xù)生長,形成上皮隔,并且有一部分發(fā)生斷裂；幼鼠出生后第15天,磨牙牙冠發(fā)育完成,牙根發(fā)育完成約2/3,可見根分叉結構；幼鼠出生后第19天,磨牙牙根已基本發(fā)育完成,可見明顯的雙根結構。而在這一階段內(nèi),切牙牙冠發(fā)育基本完成,但牙根并不繼續(xù)發(fā)育,而是逐漸形成釉質(zhì)。免疫組化染色顯示在幼鼠出生后第5天,Btbd7基因在磨牙牙胚頸環(huán)處無明顯表達；幼鼠出生后第8天,Btbd7基因主要表達在上皮根鞘區(qū)域,切牙中Btbd7基因在上皮根鞘中呈現(xiàn)弱陽性表達,而磨牙中Btbd7基因在上皮根鞘中的表達呈現(xiàn)強陽性。幼鼠出生后第11天,Btbd7基因主要表達在磨牙斷裂的上皮根鞘細胞中,且表達不甚明顯。幼鼠出世后第15天,Btbd7基因在磨牙上皮根鞘細胞中表達不甚明顯。幼鼠出生后第19天,Btbd7基因已無明顯表達。2.上皮根鞘細胞生長良好,主要為多邊形,細胞聚集在一起互相接觸類似鋪路石樣。CK14染色呈現(xiàn)陽性,細胞內(nèi)細胞質(zhì)可被染成棕褐色。3. RT-PCR結果表明,磨牙上皮根鞘細胞中Btbd7基因mRNA的表達比切牙上皮根鞘細胞中Btbd7基因mRNA的表達明顯要高4.蛋白印跡實驗(Western blot)結果證實,磨牙上皮根鞘細胞中Btbd7基因蛋白的表達比切牙上皮根鞘細胞中Btbd7基因蛋白的表達明顯要高。結論：Btbd7基因在磨牙的牙根發(fā)育過程中參與了根分叉的形成,與牙根發(fā)育形成多根牙有相關性。
【關鍵詞】：Btbd7基因 牙根發(fā)育 赫特維希上皮根鞘 上皮根鞘細胞
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R333.1
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-17
• 實驗一：Btbd7基因在大鼠切牙及磨牙牙根發(fā)育早期根端復合體中的表達變化17-20
• 材料與方法17-19
• 結果19-20
• 實驗二：上皮根鞘細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定20-23
• 材料與方法20-22
• 結果22-23
• 實驗三：BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘細胞中mRNA表達變化23-26
• 材料與方法23-25
• 結果25-26
• 實驗四：BTBD7基因在磨牙和切牙上皮根鞘細胞中蛋白表達變化26-28
• 材料與方法26-28
• 結果28
• 結論28-29
• 討論29-35
• 附圖35-41
• 參考文獻41-45
• 致謝45-46
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文目錄46-47
• 學位論文評閱及答辯情況表47

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本文編號：1016356