本文關(guān)鍵詞：CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α在香煙煙霧提取物刺激人氣道平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制

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【摘要】：第一部分香煙提取物抑制人氣道平滑肌細(xì)胞CEBPα表達(dá)而促進(jìn)了細(xì)胞增殖一、研究背景慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種發(fā)病率和死亡率較高的疾病,造成了嚴(yán)重的社會、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。香煙煙霧和其他有害顆粒的吸入是COPD的重要危險(xiǎn)因素之一,它啟動(dòng)了一系列的氣道、肺組織慢性炎癥反應(yīng),繼而出現(xiàn)氣道肺組織破壞與修復(fù),疾病進(jìn)展與氣道重塑相關(guān),是COPD氣流受限逐漸進(jìn)展的主要病理基礎(chǔ),最終影響肺功能。COPD中的氣道重塑是以粘液細(xì)胞的增生肥大、細(xì)支氣管周纖維化及氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的增殖為特點(diǎn),在氣道重塑中氣道平滑肌的增殖是其中重要環(huán)節(jié)之一。研究發(fā)現(xiàn)在吸煙的COPD患者以及熏香煙復(fù)制的大鼠COPD模型中,ASMCs都顯著增生。另一方面,ASMCs除了其收縮的機(jī)械特性外,可表達(dá)、釋放多種致細(xì)胞因子、淋巴因子及促生長因子(如IL-6、IL-8及TGF-β等),同時(shí)在炎癥介質(zhì)的作用下,促進(jìn)中性粒細(xì)胞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向氣道、肺組織局部粘附,從而加重COPD的氣道炎癥,進(jìn)一步促進(jìn)氣道重塑。故而ASMCs的增殖成為了研究COPD的氣道重塑熱點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(CEBPs)包括CEBPα、β、δ、γ、ε和ζ六個(gè)蛋白,屬于bZIP蛋白家族,是一組轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它們具有多種功能,在細(xì)胞增殖、分化、信號傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)、能量代謝、血液生成等方面發(fā)揮重要作用,與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。其中轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α (CEBPα)是一種具有抑制細(xì)胞增殖活性的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛表達(dá)于肺組織、肝臟及骨髓干細(xì)胞等。CEBPα已被證明在脂肪細(xì)胞分化、肝臟和脂肪細(xì)胞類型的調(diào)節(jié),以及能量代謝和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著重要作用。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CEBPα能抑制肝細(xì)胞的增殖,研究發(fā)現(xiàn)CEBPα基因敲除小鼠在生長發(fā)育過程中表現(xiàn)出肺組織發(fā)育不成熟,而且小鼠肺上皮細(xì)胞CEBPα基因敲除后出現(xiàn)肺上皮細(xì)胞、肺泡細(xì)胞的增殖及分化受抑制。小鼠成年后的肺組織則表現(xiàn)出類似COPD的組織學(xué)表現(xiàn)及炎癥特征,說明CEBPα在COPD發(fā)病機(jī)制的中起重要作用。在哮喘患者的ASMCs研究中發(fā)現(xiàn),CEBPα的表達(dá)是明顯下降,且在體外以室內(nèi)塵螨提取物作用于哮喘患者的ASMCs后CEBPα的表達(dá)下降,但使其細(xì)胞增殖呈明顯增加,說明室內(nèi)塵螨提取物刺激哮喘患者的ASMCs細(xì)胞增殖加速是與CEBPα的表達(dá)下降相關(guān)的,CEBPα在其中扮演著抗增殖作用。香煙煙霧是COPD重要危險(xiǎn)因素之一,體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在一定濃度CSE作用下可促進(jìn)ASMCs增殖,那么其中具體機(jī)制如何?此時(shí)抑制細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子CEBPα的表達(dá)及發(fā)揮的作用如何?我們在本研究中以不同濃度CSE刺激下體外培養(yǎng)人ASMCs,了解ASMCs的增殖情況以及相應(yīng)的CEBPα的表達(dá),探討CEBPα在CSE促進(jìn)了ASMCs的增殖中的作用。二、方法(一)、制備不同濃度的香煙提取物。(二)、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照siRNA、CEBPαsiRNA。(三)、分組。1、按照不同CSE的濃度分組：2.5% CSE組、5% CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20% CSE組、對照組,比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPα表達(dá)。2、在10%CSE濃度條件下,進(jìn)一步通過分別對人ASMCs轉(zhuǎn)染CEBPαsiRNA、陰性對照siRNA相應(yīng)分為CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組。比較兩組ASMCs的CEBPα表達(dá)及增殖程度的差異。(四)、MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度(吸光度值DD490nm表示)。(五)、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。(六)、采用免疫印跡法(Western blot法)檢測人ASMCs中CEBPα的表達(dá)。(七)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析,方差齊性時(shí)多重比較采用LSD法,方差不齊采用DuunettT3法。兩獨(dú)立樣本計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果(一)、不同CSE濃度作用下人ASMCs的增殖程度：2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20% CSE組、對照組人ASMCs的細(xì)胞增殖程度(OD490nm)分別為：0.270±0.034、0.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P0.001)。在2.5～10%CSE作用下,隨著CSE濃度的增高人ASMCs的增殖程度逐漸增加,在10%CSE作用下達(dá)到峰值,之后20%CSE濃度作用下細(xì)胞增殖程度出現(xiàn)下降趨勢。推測高于10%的CSE可能存在直接細(xì)胞毒性作用,抑制了細(xì)胞增殖,故選取2.5-10%CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。(二)、不同CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)。2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、對照組ASMCs的CEBPα蛋白表達(dá)分別為：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P0.001),提示各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而相應(yīng)地各組CEBPαmRNA表達(dá)分別為：0.696±0.126、0.713±0.125、0.677±0.142、0.661±0.133(F=0.174,P=0.912),提示各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,CEBPα蛋白表達(dá)逐漸減少,但CEBPαmRNA表達(dá)無差異。(三)、在10% CSE作用下,CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組人ASMCs中CEBPα表達(dá)及細(xì)胞增殖程度的比較。CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組中人ASMCs的CEBPα蛋白表達(dá)分別為0.232±0.084、0.378±0.119(t=2.460,P=0.034),前者顯著低于后者；而細(xì)胞增殖程度分別為0.570±0.100、0.353±0.104(t=3.666,P=0.004),前者顯著高于后者,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示采用siRNA技術(shù)抑制人ASMCs中CEBPα的表達(dá)后,細(xì)胞增殖程度反而增加。四、結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn),在香煙提取物作用下,氣道平滑肌細(xì)胞下CEBPα蛋白表達(dá)受抑制,相應(yīng)的促進(jìn)了細(xì)胞增殖。而這種CEBPα的蛋白的表達(dá)受抑制主要是受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。在采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的蛋白表達(dá)后,人ASMCs的增殖反而增加,說明CEBPα在氣道平滑肌中扮演著抗細(xì)胞增殖作用。第二部分 香煙提取物對人氣道平滑肌細(xì)胞增殖中鈣網(wǎng)織蛋白及CEBPa表達(dá)的影響一、研究背景氣道重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的一個(gè)重要特征,是COPD逐漸進(jìn)展的氣流受限的基礎(chǔ)。氣道平滑肌層的增加是氣道重塑中的特點(diǎn)之一,甚至有研究發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌層厚度與在重度至極重度COPD的氣流受限是相關(guān)。經(jīng)典的COPD動(dòng)物模型多由香煙煙霧的熏制、氣道注入內(nèi)毒素而成,顯示氣道壁以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤明顯,上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、粘液腺體及平滑肌顯著增生,管壁膠原纖維顯著增多,肺氣腫形成。研究中發(fā)現(xiàn),香煙提取物可促進(jìn)體外ASMCs的增殖。在第一部分的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)一定濃度香煙提取物作用下人氣道平滑肌細(xì)胞的CEBPα表達(dá)受抑制而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,而這種CEBPα的蛋白的表達(dá)受抑制主要是受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。那么,此時(shí)CEBPα表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制如何?研究資料已發(fā)現(xiàn)CEBPα是一種具有抑制細(xì)胞增殖活性的轉(zhuǎn)錄因子,它廣泛表達(dá)于肺組織、肝臟及骨髓干細(xì)胞等,CEBPα與慢性氣道炎癥性疾病如COPD、哮喘有著密切關(guān)系。CEBPαmRNA包含有3個(gè)翻譯起始位點(diǎn)(AUG),因此,人類CEBPαmRNA分別被翻譯成為三個(gè)大小不同的蛋白42KD、40KD和30KD,僅全長P42CEBPα有著以上的生物學(xué)功能。鈣網(wǎng)織蛋白是在CEBPαmRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中的重要調(diào)控因子之一,其機(jī)制是由于鈣網(wǎng)織蛋白與CEBPαmRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合形成了GC富集模體,而這種復(fù)合物抑制CEBPαmRNA翻譯為全長42KD的CEBPα,從而抑制了其生物學(xué)活性。在脂肪細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)CEBPα與鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)是呈負(fù)相關(guān),且近期在哮喘患者的研究中發(fā)現(xiàn)其ASMCs中CEBPα的低表達(dá)是受鈣網(wǎng)織蛋白調(diào)控的。那么在不同濃度CSE作用下,ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)如何?香煙提取物促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖是否與CEBPα的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要因子——鈣網(wǎng)織蛋白有關(guān)?我們在本研究中以不同濃度香煙提取物刺激下體外培養(yǎng)人氣道平滑肌細(xì)胞,了解抑制細(xì)胞增殖的重要因子CEBPα和其上游調(diào)控因子——鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá),探討CEBPα上游調(diào)節(jié)因子鈣網(wǎng)織蛋白在香煙提取物促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖中發(fā)揮的作用。二、方法(一)、制備不同濃度的香煙提取物。(二)、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對照siRNA至人氣道平滑肌細(xì)胞。(三)、分組1、按照不同CSE的濃度分組：2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20%CSE組、對照組,比較各組間ASMCs的增殖程度及CEBPα表達(dá)。2、在10%CSE濃度條件下,進(jìn)一步通過分別對ASMCs轉(zhuǎn)染鈣網(wǎng)織蛋白siRNA及陰性對照siRNA相應(yīng)分為鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組及陰性對照siRNA組。比較兩組ASMCs的CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖程度的差異。(四)、以MTT比色法分析各組人ASMCs的增殖程度(吸光度值OD490nm表示)。(五)、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組人ASMCs中CEBPα的mRNA水平。(六)、采用免疫印跡法(Western blot法)檢測各組人ASMCs中CEBPα、鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)。(七)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析,方差齊性時(shí)多重比較采用LSD法,方差不齊采用DuunettT3法。兩獨(dú)立樣本計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果(一)、不同CSE濃度作用下人ASMCs的增殖程度：2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20% CSE組、對照組ASMCs的細(xì)胞增殖程度(OD490nm)分別為：0.270±0.034、0.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P0.001)。在2.5～10%CSE作用下,隨著CSE濃度的增高ASMCs的增殖程度逐漸增加,在10%CSE作用下達(dá)到峰值,之后15%CSE、20%CSE濃度條件下則細(xì)胞增殖程度出現(xiàn)下降趨勢。說明高于10%的CSE可能存在直接細(xì)胞毒性作用,抑制了細(xì)胞增殖,故選取2.5～10%CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。(二)、不同CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)。2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、對照組ASMCs的CEBPα蛋白表達(dá)分別為：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P0.001),提示各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而相應(yīng)地CEBPamRNA表達(dá)分別為：0.696±0.126、0.713±0.125、0.677±0.142、0.661±0.133(F=0.174,P=0.912),提示各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,CEBPα蛋白表達(dá)逐漸減弱,但CEBPamRNA表達(dá)無差異。(三)、不同CSE濃度下人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)。2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、對照組ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)分別為：0.489±0.088、0.620±0.103、0.771±0.087、0.293±0.092(F=28.628,P0.001),各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)逐漸增加。(四)、在10% CSE作用下,鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組、陰性對照siRNA組人ASMCs中鈣網(wǎng)織蛋白、CEBPa表達(dá)、細(xì)胞增殖程度的比較。鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組、陰性對照siRNA組中人ASMC的鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)分別為0.544±0.132、0.754±0.126(t=2.826,P=0.018),前者顯著低于后者；CEBPα蛋白表達(dá)分別為0.547±0.063、0.380±0.180(t=3.285,P=0.008),前者顯著高于后者；而細(xì)胞增殖程度分別為0.262±0.065、0.390±0.079(t=3.082,P=0.012),前者顯著低于后者,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示在10%CSE條件下,鈣網(wǎng)織蛋白siRNA組較陰性對照siRNA組中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)減弱,但CEBα表達(dá)增強(qiáng),而相應(yīng)地細(xì)胞增殖程度減弱。四、結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn),一定濃度CSE作用下,人氣道平滑肌細(xì)胞中鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)隨著CSE濃度增加而增強(qiáng),而CEBPα的蛋白表達(dá)隨著CSE濃度增加而減弱。采用siRNA技術(shù)抑制鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)后,反而CEBPα蛋白表達(dá)增強(qiáng),繼而氣道平滑肌細(xì)胞增殖減弱。說明在一定濃度CSE作用下ASMCs中CEBPα的蛋白表達(dá)受抑制是受鈣網(wǎng)織蛋白調(diào)控的,進(jìn)而影響了ASMCs的增殖。第三部分香煙提取物通過CEBPα調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)了人氣道平滑肌細(xì)胞增殖一、研究背景CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CEBP)家族包括CEBPα、β、δ、γ、ε和ζ六個(gè)蛋白,屬于bZIP蛋白家族,其中CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α (CEBPα)是一種具有抑制細(xì)胞增殖活性的轉(zhuǎn)錄因子,它廣泛表達(dá)于肺組織、肝臟及骨髓干細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)CEBPα通過直接抑制細(xì)胞周期的限速酶——細(xì)胞周期蛋白激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白激酶4(CDK4)以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制劑p21Wafl/Cipl的表達(dá)等多方面機(jī)制進(jìn)而阻滯了細(xì)胞周期,最終抑制了細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程,細(xì)胞周期在不同時(shí)相的多個(gè)調(diào)控點(diǎn)上受到調(diào)節(jié),其中主要有三個(gè)調(diào)控點(diǎn)即Gl/S、G2/M和有絲分裂中期/后期,而G1/S的調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)外信號經(jīng)過傳遞、整合匯集到細(xì)胞核,對細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn),通過此點(diǎn)后,細(xì)胞的分裂、增殖基本上是由細(xì)胞內(nèi)部自主完成的過程。研究發(fā)現(xiàn)在CEBPa基因敲除的肝細(xì)胞中,CDK2、CKD4的表達(dá)增強(qiáng),肝細(xì)胞增殖加速,CEBPα是通過直接及間接作用于CDK2、CKD4而發(fā)揮了生物學(xué)效應(yīng)。在以上兩部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)一定濃度香煙提取物(CSE)抑制了人氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)中CEBPα表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞增殖,那么CEBPα是如何發(fā)揮其抗細(xì)胞增殖的效應(yīng)呢?此時(shí)與其密切相關(guān)的CDK2、CKD4的表達(dá)如何?受抑制的CEBPα是否通過影響CDK2、CKD4的表達(dá)而干預(yù)細(xì)胞周期最終促進(jìn)細(xì)胞增殖呢?我們在本研究中以不同濃度香煙提取物作用于體外培養(yǎng)人ASMCs,了解人ASMCs中抑制細(xì)胞增殖的重要因子CEBPα以及細(xì)胞周期重要限速酶CDK2、CDK4的表達(dá)變化,并分析細(xì)胞周期各期比例變化,另外,采用siRNA技術(shù)抑制CEBPα的表達(dá)后CDK2、CDK4的表達(dá)及細(xì)胞周期各期比例的變化,從而探討在香煙提取物作用下CEBPa是否通過調(diào)控細(xì)胞周期的分布而發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的作用。二、方法(一)、制備不同濃度的香煙提取物。(二)、采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的CEBPasiRNA、陰性對照siRNA。(三)、分組1、按照不同CSE的濃度分組：2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20%CSE組及對照組,比較各組間人ASMCs的增殖程度及CEBPa表達(dá)。2、在10%CSE濃度條件下,進(jìn)一步通過分別對人ASMCs轉(zhuǎn)染CEBPαsiRNA、陰性對照siRNA相應(yīng)分為CEBPasiRNA組、陰性對照siRNA組。比較兩組人ASMCs的CEBPα表達(dá)、細(xì)胞周期分布及增殖程度的差異。(四)、以MTT比色法分析人ASMCs的增殖程度(吸光度值OD490nm表示)。(五)、采用免疫印跡法(Western blot法)檢測人ASMCs中CEBPα、CDK2及CDK4的表達(dá)。(六)、流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期測定,計(jì)算各組人ASMCs中G0/G1期細(xì)胞比例、S期、G2/M期細(xì)胞比例。(七)、使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料以x±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,方差齊性時(shí)多重比較采用LSD法,方差不齊采用DuunettT3法。兩獨(dú)立樣本均數(shù)計(jì)量資料比較t檢驗(yàn)。P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果(一)、不同CSE濃度下人ASMCs的增殖程度2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、15%CSE組、20%CSE組、對照組ASMC的細(xì)胞增殖程度(OD490nm表示)分別為：0.270±0.0330.321±0.041、0.368±0.043、0.293±0.033、0.259±0.034、0.187±0.024(F=18.43,P0.001)。即隨CSE濃度的增高人ASMCs的增殖程度起初逐漸增加,在10%CSE作用下達(dá)到峰值,之后15%CSE、20%CSE濃度組則出現(xiàn)下降趨勢。推測高于10%的CSE可能存在直接細(xì)胞毒性作用,故選取2.5～10%CSE作為后續(xù)試驗(yàn)刺激濃度。(二)、2.5～10%CSE濃度下人ASMCs的CEBPα的表達(dá)2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組及對照組人ASMC相應(yīng)的CEBPα蛋白表達(dá)分別為：0.622±0.084、0.497±0.098、0.368±0.077、0.733±0.101(F=18.238,P0.001),各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,CEBPα蛋白表達(dá)逐漸減弱。(三)、2.5～10%CSE濃度下人ASMCs的CDK2、CDK4的表達(dá)2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組、對照組中ASMC的CDK2表達(dá)分別為：0.288±0.060、0.460±0.043、0.689±0.083、0.198±0.035(F=82.746,P0.001),CDK4表達(dá)分別為：0.322±0.037、0.579±0.090、0.726±0.066、0.208±0.036(F=88.408,P0.001),各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,CDK2、CDK4的表達(dá)均逐漸增加。(四)、2.5～10%CSE濃度下人ASMCs中G0/G1、S期、G2/M期細(xì)胞比例(%)的比較。2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組及對照組中ASMC的G0/G1期細(xì)胞比例(%)分別為：72.1±2.8、62.3±3.8、54.0±6.0、77.8±4.3(F=34.616,0.001),各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；S期細(xì)胞比例(%)分別為：23.8±2.9、33.9±4.1、40.8±2.6、17.5±3.0(F=61.419,0.001),各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；G2/M期細(xì)胞比例(%)分別為：4.1±1.7、3.9±2.5、5.2±3.6、4.7±1.6(F=0.357,P=0.785),各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示隨著CSE濃度的遞增,G0/G1期細(xì)胞比例遞減,S期細(xì)胞比例遞增,G2/M期細(xì)胞無顯著變化。(五)、在10%CSE作用下,CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組中CEBPα表達(dá)、細(xì)胞增殖程度及細(xì)胞周期分布的比較。CEBPαsiRNA組、陰性對照siRNA組中ASMCs的CEBPα蛋白表達(dá)分別為0.232±0.084、0.378±0.119(t=2.460,P=0.034),前者顯著低于后者；而細(xì)胞增殖程度分別為0.562±0.050、0.353±0.038(t=8.144,P0.001),前者顯著高于后者,CDK2的表達(dá)分別為0.778±0.045、0.654±0.085(t=3.148,P=0.010),前者顯著高于后者；CDK4的表達(dá)分別為0.792±0.062、0.709±0.044(t=2.653,P=0.024),前者顯著高于后者；G0/G1期細(xì)胞比例(%)分別為44.9±1.8、57.7±4.6(t=6.277,0.001),前者顯著低于后者；S期細(xì)胞比例(%)分別為43.7±4.1、34.7±6.3(t=2.916,P=0.015),前者顯著高于后者；G2/M期細(xì)胞比例(%)分別為13.4±3.0、8.3±2.5(t=3.225,P=0.009),前者顯著高于后者,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示在10%CSE作用下,CEBPasiRNA組較陰性對照siRNA組ASMCs中CEBPα表達(dá)減弱,而CDK2、CDK4表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)而細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少,同時(shí)S期、G2/M期細(xì)胞比例顯著增多,最終加速細(xì)胞增殖。四、結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn),一定濃度CSE作用下ASMCs中CEBPα的表達(dá)受抑制,進(jìn)而促進(jìn)了其下游細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)者CDK2、CDK4活性表達(dá),從而使G0/G1期細(xì)胞比例減少、細(xì)胞周期中S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高,這表明細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化加速,最終促進(jìn)了ASMCs的增殖�？偨Y(jié)以上一系列研究發(fā)現(xiàn),一定濃度CSE作用下人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖加速,其中的機(jī)制考慮與人氣道平滑肌細(xì)胞中鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān),進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制了CEBP/α mRNA的翻譯,導(dǎo)致CEBP/α的蛋白表達(dá)受抑制,繼而促進(jìn)了其下游的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)者CDK2、CDK4活性表達(dá),使S期、G2/M細(xì)胞比例顯著升高,這表明細(xì)胞由G1向S期的轉(zhuǎn)化加速,最終促進(jìn)了氣道平滑肌細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：香煙提取物 氣道平滑肌細(xì)胞 CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α 鈣網(wǎng)織蛋白 增殖細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R56
【目錄】：

• 摘要3-16
• ABSTRACT16-33
• 第一部分 香煙提取物抑制CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α的表達(dá)而促進(jìn)了人氣道平滑肌細(xì)胞的增殖33-54
• 研究背景33-34
• 一、材料與儀器34-37
• 二、方法37-43
• 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法43
• 四、結(jié)果43-49
• 五、討論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 第二部分 香煙提取物對人氣道平滑肌細(xì)胞增殖中鈣網(wǎng)織蛋白及CEBPα表達(dá)的影響54-77
• 研究背景54-56
• 一、材料與儀器56-59
• 二、方法59-65
• 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法65
• 四、結(jié)果65-71
• 五、討論71-73
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 第三部分 香煙提取物通過CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)了人氣道平滑肌細(xì)胞增殖的研究77-97
• 研究背景77-78
• 一、材料與儀器78-81
• 二、方法81-86
• 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法86
• 四、結(jié)果86-93
• 五、討論93-95
• 參考文獻(xiàn)95-97
• 全文總結(jié)97-98
• 綜述98-120
• 參考文獻(xiàn)109-120
• 博士期間成果120-121
• 致謝121-123
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明123

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本文編號：914090