矽塵暴露人群血清生物標志物的篩選及其相關(guān)功能的初步研究

發(fā)布時間：2020-11-22 02:17

　　矽肺(silicosis)是由于長期吸入大量游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的以肺間質(zhì)纖維化為主的全身性疾病,在我國是危害最嚴重的職業(yè)病之一。在我國平均每例塵肺病人每年經(jīng)濟損失約為3.41萬元,每年僅因塵肺病造成的直接經(jīng)濟損失達140多億元,每年新增塵肺病例造成的經(jīng)濟損失達6億元。近年來矽肺病的流行呈現(xiàn)出群發(fā)性、低齡化以及致殘率高的新特點,這給矽肺的防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多對矽肺的診斷有價值的血清生物標志物,如肺特異性的克拉拉細胞蛋白(CC16)、肺表面活性物質(zhì)D(SP-D)作為診斷指標仍存在敏感性、特異性不足的缺點,不同類型的肺間質(zhì)病之間這些指標重疊較大;而支氣管肺泡灌洗液的化學及細胞學檢查僅能作為影像學診斷的補充。運用新技術(shù)手段篩選高特異性、敏感性的標志物將對矽肺的早期防治起到重要的推動。液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是一種基于磁珠分選與基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)聯(lián)合應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),可直接檢測臨床未經(jīng)特殊處理的血清、尿液、腦脊液或漿膜腔積液等標本,對疾病(特別是腫瘤)的診斷有較高的敏感性和特異性。本研究采用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測矽塵暴露人群血清蛋白的表達,篩選出矽肺發(fā)病早期的生物標志物建立矽肺早期診斷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型并對鑒定出的標志物進行相關(guān)功能的初步研究。研究目的應(yīng)用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)篩選矽塵暴露人群早期診斷血清生物標志物,并對鑒定出的生物標志物進行初步功能研究。研究方法矽塵暴露人群85例為山西省陽泉市某耐火材料廠接觸游離二氧化硅粉塵的工人,統(tǒng)一攝高千伏X射線后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s),由具有診斷資格的診斷專家組按照《塵肺病診斷標準GBZ70-2002》進行診斷,分為矽塵暴露組(無塵肺0期)、可疑矽肺組(無塵肺0+期)和I期矽肺組;30例非暴露正常對照組為某單位年度體檢人員,均無矽塵暴露史。本研究首先應(yīng)用invitrogen公司生產(chǎn)的Dynabeads RPC18磁珠,對矽塵暴露人群和非暴露正常對照組的血清進行蛋白質(zhì)(多肽)的分選,然后對分選后的蛋白(多肽)采用MALDI-TOF-MS的一級質(zhì)譜技術(shù)和ClinProTools分析軟件進行差異蛋白峰的篩選,同時應(yīng)用Matlab分析軟件建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型,最后對篩選出的差異蛋白質(zhì)峰采用MALDI-TOF-MS二級質(zhì)譜技術(shù)進行氨基酸序列鑒定。按照二級質(zhì)譜鑒定出來的氨基酸序列人工合成差異蛋白,并用不同濃度的蛋白溶液作為刺激物,觀察其對矽肺形成過程中的靶細胞人胚肺成纖維細胞(MRC-5)的影響。研究結(jié)果 1.一級質(zhì)譜尋找差異顯著峰結(jié)果:利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(SNN)建立模型進行各組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)0期與0+期、0期與I期、0+期與I期比較,其識別率分別為64.35%、84.38%和73.49%,其交叉驗證能力分別為63.14%、52.82%和69.07%;而正常對照組(control)與0期、正常對照組與0+期、正常對照組與I期比較,其識別率分別為89.23%、98.52%和98.96%交叉驗證能力分別為87.66%、94.20%和85.53%。由上可知,0期與0+期、0期與I期、0+期與I期比較,其識別率和交叉驗證能力都較差;而正常對照組(control)與0期、正常對照組與0+期、正常對照組與I期比較,其識別率和交叉驗證能力都較好。因此,僅對0期、0+期、I期與正常對照組的差異顯著峰進行提取,共得到5個差異峰(P0.01),其中5081Da和5066Da為表達上調(diào)的蛋白峰,2021da、3954da和1777da為表達下調(diào)的蛋白峰。 2.二級質(zhì)譜鑒定差異顯著峰氨基酸序列結(jié)果:根據(jù)二級質(zhì)譜儀器要求,選擇分子量3KDa的峰2021Da和1777Da進行二級質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列結(jié)果兩蛋白質(zhì)峰同為補體C3的一個片段C3f。 3.矽塵暴露人群接塵量與差異峰強度相關(guān)性分析:接塵量與5081Da、5066Da、3954Da、2021Da和1777Da 5個差異顯著峰的峰強的相關(guān)系數(shù)依次為r5081=0.039(P=0.614)、r5066=0.104(P=0.180)、r3954=-0.047(P=0.543)、r2021=-0.028(P=0.714)、r1777=-0.016 (P=0.853),5個差異蛋白峰強度與接塵量均不存在相關(guān)性。 4.矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的建立:篩選出峰效果較好的2021Da、2554Da、5066Da、8600Da 4個P0.001的共同差異蛋白質(zhì)峰建立矽塵暴露人群診斷模型,其區(qū)分矽塵暴露人群與正常對照組的特異性為100%,敏感性為90%,準確率為92.3%;該模型診斷0期、0+期和I期的識別率分別為100%、93%和96%。 5.不同濃度C3f刺激對MRC-5細胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β_1表達量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β_1的表達量均呈進行性降低。與對照組相比,各濃度點均有顯著差異(P0.05)。 6.不同濃度C3f刺激對MRC-5胞質(zhì)中TGF-β_1表達量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,MRC-5胞質(zhì)中TGF-β_1的積分光密度值呈進行性降低,各濃度點均有顯著差異(P0.05) 研究結(jié)論 1.運用液體芯片飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的一級質(zhì)譜尋找矽塵暴露人群差異蛋白,并成功建立了矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型。 2.運用液體飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的二級質(zhì)譜技術(shù)鑒定出1777Da和2021Da同為C3f,后續(xù)的細胞功能研究證明C3f能夠減少MRC-5細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β_1的形成。綜上所述,本研究成功建立的矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型為矽肺的早期診斷提供了一種全新而有效的方法,后續(xù)對差異蛋白C3f功能的初步研究結(jié)果也為進一步探討矽肺發(fā)病的免疫機制提供了研究線索。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R135.2
【部分圖文】：

矽塵,分子水平,細胞因子

以及間質(zhì)細胞中膠原和其他細胞外基質(zhì)過度沉積。其中 AMs 為纖維生成的中樞細胞，并參與細胞因子的生成和氧化性物質(zhì)的產(chǎn)生[3]。此外，多種免疫細胞包括中性粒細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞也可積聚于肺間質(zhì)，參與纖維形成過程[4-6]。這些效應(yīng)細胞和靶細胞（包括肺巨噬細胞、成纖維細胞、支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞）之間復(fù)雜的相互作用為矽肺纖維化發(fā)展和病理過程的細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。SiO2顆粒進入肺組織后與細胞外物質(zhì)反應(yīng)，刺激巨噬細胞對其進行吞噬清除。此時，在細胞水平上巨噬細胞已被活化，在分子水平轉(zhuǎn)錄因子活化并且釋放 ROS 和 RNS，趨化因子，溶酶體酶，細胞因子，和生長因子，最終細胞死亡（壞死／凋亡），釋放顆粒。巨噬細胞受損后，釋放的多種細胞因子參與刺激成纖維細胞增生和膠原的合成，并能啟動免疫系統(tǒng)多種細胞產(chǎn)生效應(yīng)。同時，肺泡Ⅰ型上皮細胞在 SiO2顆粒的作用下，變性腫脹、崩解脫落；當肺泡Ⅱ上皮細胞不能及時補修時，基底膜受損松解、暴露間質(zhì)，也可以刺激成纖維細胞增生。如圖 1 所示。

矽塵暴露人群血清生物標志物的篩選及其相關(guān)功能的初步研究