本文關(guān)鍵詞：雙鏈核糖核酸（dsRNA）的產(chǎn)生及其調(diào)控的信號(hào)通路在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的:Alu RNA是人類基因組中SINE家族的最主要成員,B型RNA是與Alu RNA同源的小鼠SINE。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示非編碼RNA與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān),與疾病相關(guān)。但Alu序列約占人類基因組的10%,一直以來(lái)被認(rèn)為是“垃圾”序列,所以,Alu RNA的產(chǎn)生及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)病死率高,脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)則是其主要致病物質(zhì)。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)LPS等損傷性因素造成“呼吸爆發(fā)”導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在ALI的病理發(fā)展過(guò)程中扮演重要的角色。有研究提示氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Alu RNA的產(chǎn)生,但ALI過(guò)程中Alu RNA的產(chǎn)生及其調(diào)控的分子機(jī)制尚未闡明。本課題將通過(guò)建立小鼠ALI模型,探討Alu RNA同源分子B型RNA如何參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展及其分子機(jī)制,為急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論基礎(chǔ)。方法和材料:本課題借助LPS誘導(dǎo)BALB/c小鼠ALI模型,利用分子克隆技術(shù)、原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)、免疫組化技術(shù)、Real-Time PCR技術(shù)、Western blot技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和MTS實(shí)驗(yàn)分別在體外和體內(nèi)探討B(tài)型RNA參與急性肺損傷引起炎癥反應(yīng)的過(guò)程,揭示B1 RNA激活NLRP3炎性小體及炎癥因子表達(dá)的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第一部分:LPS誘導(dǎo)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生B型RNA來(lái)源的雙鏈RNA首先我們通過(guò)雙氧水刺激A549細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型,使用特異性識(shí)別雙鏈RNA的抗體與提取的H2O2刺激的A549細(xì)胞總RNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交,結(jié)果證實(shí)雙氧水刺激的A549細(xì)胞內(nèi)含有ds RNA,而這種ds RNA被證實(shí)是Alu RNA。然后我們利用可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的脂多糖LPS誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞,觀察LPS刺激過(guò)程中,是否也有Alu RNA的表達(dá),結(jié)果證實(shí)LPS誘導(dǎo)的人A549細(xì)胞模型中Alu RNA的表達(dá)增加。在此基礎(chǔ)上,我們使用磁珠分選的方法分離獲得小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,利用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定了分離的原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的純度;使用LPS作用于細(xì)胞,建立原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的ALI模型;LPS刺激24h后收取細(xì)胞,通過(guò)RNA免疫沉淀技術(shù)(RNA Binding Protein Immuno-precipitation,RIP)捕獲了細(xì)胞內(nèi)的ds RNA,利用T-A克隆的方法構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)ds RNA的c DNA文庫(kù),并通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)證實(shí)了ds RNA主要為B1 RNA。第二部分:LPS誘導(dǎo)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞B型RNA的表達(dá)和調(diào)控信號(hào)通路重要分子的活化首先,通過(guò)q RT-PCR法檢測(cè)了LPS誘導(dǎo)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中B1、B2及B4 RNA的表達(dá)水平,我們證實(shí)LPS誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中B1和B2 RNA表達(dá)增加。其次,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中NLRP3炎性信號(hào)通路活化。通過(guò)q RT-PCR法檢測(cè)了LPS誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄增加,ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌水平也明顯增加。接下來(lái),我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的NF-κB介導(dǎo)了B1 RNA誘導(dǎo)的NLRP3信號(hào)通路的活化。Western blot和q RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示LPS應(yīng)激后Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中不僅NLRP3及其下游細(xì)胞因子被上調(diào),NF-κB亦被磷酸化激活;為了鑒定NF-κB磷酸化與ds RNA的相關(guān)性,應(yīng)用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)揭示了ds RNA表達(dá)增高,分布于細(xì)胞核及核周,并與磷酸化的NF-κB具有共定位關(guān)系,強(qiáng)烈提示NF-κB參與了NLRP3炎性通路的活化;通過(guò)在LPS誘導(dǎo)的原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中使用NF-κB磷酸化特異性抑制劑PDTC,q RT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌;接下來(lái),我們克隆并構(gòu)建了B1 RNA的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-B1進(jìn)入原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)證實(shí),B1 RNA的轉(zhuǎn)染和過(guò)表達(dá)可顯著增加NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和翻譯,但該現(xiàn)象可被PDTC所抑制。最后我們利用MTS法檢測(cè)了原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染B1 RNA后的細(xì)胞活力變化,結(jié)果顯示LPS處理和B1 RNA的轉(zhuǎn)染都能夠降低原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的活力,相應(yīng)地,這種抑制作用能夠被PDTC所改善。第三部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究LPS誘導(dǎo)B型RNA的產(chǎn)生及其調(diào)控的信號(hào)通路在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制我們通過(guò)氣管灌注的方法建立LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型,并分離小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,與體外實(shí)驗(yàn)一致的是,q RT-PCR法證實(shí)了Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中B1和B2的表達(dá)增加,Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NF-κB的磷酸化水平及NLRP3表達(dá)增加,ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌增加。并利用免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LPS處理后小鼠肺組織中NF-κB磷酸化,NLRP3的表達(dá)及ds RNA的增加。結(jié)論:通過(guò)本課題研究,我們初步證實(shí)在LPS應(yīng)激作用下,A549和小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中可產(chǎn)生Alu RNA來(lái)源的ds RNA。在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中,這些雙鏈RNA以B1 RNA為主。小鼠體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)B1 RNA轉(zhuǎn)錄增加可上調(diào)NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)NF-κB磷酸化水平證實(shí),B1 RNA可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB磷酸化介導(dǎo)NLRP3以及促炎因子的表達(dá),在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。不僅揭示了B1 RNA激活NLRP3炎性小體及炎癥因子表達(dá)的機(jī)制,同時(shí),為急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：脂多糖 B型RNA 雙鏈RNA NF-κB NLRP3 Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-28
• 第一部分 LPS誘導(dǎo)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生B型RNA來(lái)源的雙鏈RNA28-47
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 第二部分 LPS誘導(dǎo)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮 細(xì)胞B型RNA的表達(dá)和調(diào)控信號(hào)通路重要分子的活化47-72
• 1 實(shí)驗(yàn)材料48-50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-61
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-69
• 4 討論69-72
• 第三部分 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究LPS誘導(dǎo)B型RNA的產(chǎn)生及其調(diào)控的信號(hào)通路在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制72-81
• 1 實(shí)驗(yàn)材料72-74
• 2 實(shí)驗(yàn)方法74-76
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-79
• 4 討論79-81
• 小結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-93
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果93-94
• 致謝94

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本文編號(hào)：891020