本文關(guān)鍵詞：IL31與特發(fā)性肺纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 特發(fā)性肺纖維化 地塞米松 博來(lái)霉素 羥基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs

【摘要】：目的：在特發(fā)性肺纖維化(IPF)過(guò)程中,起主要作用的TGF-β在炎癥部位活性增強(qiáng),使成纖維細(xì)胞大量增殖,導(dǎo)致嚴(yán)重肺纖維化,TGF-β通過(guò)Smads蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控發(fā)揮作用。而Smad-3是介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化的關(guān)鍵分子,其通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因而影響IL-6家族特別是IL-31的表達(dá),進(jìn)一步影響JAKs/STATs通路,從而引起肺纖維化。這是肺纖維化可能的機(jī)制。因此,本項(xiàng)目旨在利用體外培養(yǎng)細(xì)胞及BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,得到TGF-β1-Smad-3-IL-31-JAKs/STATs這條通路,研究這條通路是肺纖維化的可能作用機(jī)制,以對(duì)肺纖維化的靶向治療提供一定的線索。 方法：將75只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。其中二組為博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型組(氣管內(nèi)注射BLM5mg/kg0.1mL),分別為單純?cè)炷＝M(BLM組,25只)、地塞米松治療組(DXM組,25只)、每組25只；造模后1天,地塞米松組小鼠腹腔注射DXM5mg/kg1(0.1mL),每天1次,連續(xù)28天。另1組為正常對(duì)照組(NC組,25只)。給藥第3、7、14、21、28天每組分別各處死5只小鼠。取肺組織行常規(guī)組織病理學(xué)觀察；免疫組化檢測(cè)肺組織中TGF-β1、Smad-3含量;RT-PCR法檢測(cè)IL-31、STAT-1mRNA的表達(dá)量；Western blot測(cè)STAT-1蛋白含量；染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad-2/3與IL-31啟動(dòng)子之間的結(jié)合聯(lián)系。同時(shí)制得原代肺成纖維細(xì)胞,待培養(yǎng)3代后,抑制TGF-β表達(dá),而對(duì)TGF-β表達(dá)的抑制,會(huì)下調(diào)Smad-3、IL-31的表達(dá)水平。對(duì)IL-31表達(dá)的降低,則會(huì)下調(diào)STAT-1的表達(dá)水平。同時(shí)查看肺成纖維細(xì)胞的形態(tài),肺成纖維細(xì)胞的增殖特征,肺成纖維細(xì)胞的膠原合成；檢測(cè)肺組織中羥基脯氨酸(HYP)含量。 結(jié)果： (1)對(duì)小鼠肺初步肉眼觀察和對(duì)肺組織病理學(xué)的觀察,可發(fā)現(xiàn)由于BLM的誘導(dǎo)作用,BLM組小鼠的肺組織根據(jù)時(shí)間先后順序出現(xiàn)由3天時(shí)的輕度肺泡炎到14天時(shí)纖維化的動(dòng)態(tài)改變。DXM組也呈現(xiàn)類(lèi)似的病理改變過(guò)程,但其程度較BLM組輕,但是,對(duì)比NC組,其程度卻明顯加重。NC組病理變化基本未見(jiàn),沒(méi)有明顯的肺泡炎和纖維化改變。 (2) TGF-β1在NC組肺組織有弱表達(dá),在BLM組7天-14天表達(dá)達(dá)高峰,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。28天TGF-β1表達(dá)明顯降低。DXM組7天-14天后的TGF-β1明顯低于BLM組,地塞米松能夠明顯降低TGF-β1的表達(dá)。 BLM組肺組織Smad3表達(dá)增強(qiáng),第7天時(shí)明顯高于NC組,隨后下降,但直至第28天時(shí)BLM組中Smad3的表達(dá)仍明顯高于NC組。DXM組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織Smad3表達(dá)水平均明顯低于BLM組。 (3)跟NC組相比,BLM組的IL-31及STAT-1mRNA從第7天開(kāi)始升高,第14天達(dá)到高峰,后逐漸下降,但到28天仍高于NC組。有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 DXM組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織IL-31及STAT-1mRNA表達(dá)水平明顯低于實(shí)驗(yàn)組。 經(jīng)Western blot法檢測(cè)STAT-1蛋白發(fā)現(xiàn)NC組小鼠肺內(nèi)僅有少量STAT-1蛋白表達(dá)。BLM組小鼠的病變?cè)缙?第7天),肺組織中的STAT-1蛋白表達(dá)水平即增高,且隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì),到第14天時(shí)達(dá)到高峰,第28天下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。DXM組也呈現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì),但比BLM組的表達(dá)明顯減輕,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (4)用抗Smad-3抗體進(jìn)行免疫沉淀蛋白質(zhì)DNA交聯(lián)復(fù)合物,用RT-PCR檢測(cè)IL-31啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)與NC組相比,BLM組的IL-31啟動(dòng)子明顯增高。第21天達(dá)到高峰,到28天仍明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (5)對(duì)TGF-β表達(dá)的抑制,則會(huì)下調(diào)Smad-3、IL-31的表達(dá)水平。 (6)而對(duì)IL-31表達(dá)的降低,則會(huì)下調(diào)STAT-1的表達(dá)水平。 (7)BLM組與NC對(duì)照組相比,肺組織中羥基脯氨酸含量第14天開(kāi)始上升,第28天達(dá)到峰值(p0.01)；DXM治療組HYP含量于14-28天有明顯下降(p0.05)。 結(jié)論： 我們利用免疫組織化學(xué)、Western blot. RT-PCR及CHIP等方法對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中TGF-β1、Smad-3、IL-31、STAT-1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這四者在一定程度上,具有表達(dá)水平共同升高或者降低的趨勢(shì),而CHIP的使用,則進(jìn)一步證明了前人并沒(méi)有證明的Smad-3通過(guò)與Il-31的結(jié)合而誘發(fā)下游JAK/STAT通路激活的作用。
【關(guān)鍵詞】：特發(fā)性肺纖維化 地塞米松 博來(lái)霉素 羥基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R563
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-18
• 注釋表18-20
• 第一章 緒論20-36
• 1.1 特發(fā)性肺纖維化概述20-21
• 1.2 特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展21-26
• 1.2.1 肺泡上皮細(xì)胞受損21-22
• 1.2.2 成纖維細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生細(xì)胞的聚集22
• 1.2.3 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化22-23
• 1.2.4 細(xì)胞調(diào)亡23
• 1.2.5 細(xì)胞因子的作用23-25
• 1.2.6 凝血—纖溶系統(tǒng)25
• 1.2.7 Wnt信號(hào)途徑25-26
• 1.2.8 Rho/Rho激酶信號(hào)通路26
• 1.3 特發(fā)性肺纖維化臨床治療進(jìn)展26-29
• 1.3.1 糖皮質(zhì)激素治療26-27
• 1.3.2 細(xì)胞毒性藥物27
• 1.3.3 針對(duì)細(xì)胞氧化/抗氧化失衡的抗氧化和自由基治療27-28
• 1.3.4 IPF的抗凝治療28
• 1.3.5 抗纖維化28
• 1.3.6 肺移植28-29
• 1.3.7 其它29
• 1.4 特發(fā)性肺纖維化與TGF-β信號(hào)通路的關(guān)系29-33
• 1.5 IPF動(dòng)物模型33-34
• 1.6 本課題研究的目的及意義34-35
• 1.7 技術(shù)路線35-36
• 第二章 博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型制備及組織形態(tài)學(xué)觀察36-47
• 2.1 材料與方法36-42
• 2.1.1 材料36-38
• 2.1.2 方法38-41
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法41-42
• 2.2 結(jié)果42-45
• 2.2.1 肉眼初步對(duì)組織進(jìn)行觀察42-44
• 2.2.2 肺泡炎及肺纖維化評(píng)分結(jié)果44-45
• 2.3 討論45-47
• 第三章 免疫組化檢測(cè)TGF-β1與Smad3的表達(dá)水平47-57
• 3.1 材料與方法47-52
• 3.1.1 材料47-49
• 3.1.2 方法49-51
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法51-52
• 3.2 結(jié)果52-54
• 3.2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺組織中TGF-β1表達(dá)52-53
• 3.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織中Smad3蛋白的表達(dá)水平53-54
• 3.3 討論54-57
• 第四章 IL-31、STAT-1的表達(dá)水平檢測(cè)57-72
• 4.1 材料與方法57-67
• 4.1.1 材料57-59
• 4.1.2 方法59-66
• 4.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法66-67
• 4.2 結(jié)果67-69
• 4.2.1 IL-31的表達(dá)水平67-68
• 4.2.2 小鼠肺組織STAT-1蛋白表達(dá)水平68-69
• 4.3 討論69-72
• 第五章 染色質(zhì)共沉淀法檢測(cè)Smad-3與IL-31啟動(dòng)子的結(jié)合72-78
• 5.1 材料與方法72-75
• 5.1.1 材料72-74
• 5.1.2 方法74-75
• 5.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法75
• 5.2 結(jié)果75-76
• 5.3 討論76-78
• 第六章 TGF-β通路抑制劑SB431542處理細(xì)胞影響Smad-3的表達(dá)78-83
• 6.1 材料與方法78-81
• 6.1.1 材料78-80
• 6.1.2 方法80-81
• 6.2 結(jié)果81-82
• 6.3 討論82-83
• 第七章 敲減IL-31對(duì)STAT-1的表達(dá)影響83-87
• 7.1 材料與方法83-85
• 7.1.1 材料83-85
• 7.1.2 方法85
• 7.2 結(jié)果85-86
• 7.3 討論86-87
• 第八章 地塞米松對(duì)細(xì)胞因子及羥脯氨酸的影響87-92
• 8.1 材料與方法87-89
• 8.1.1 材料87-88
• 8.1.2 方法88-89
• 8.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法89
• 8.2 結(jié)果89-90
• 8.3 討論90-92
• 第九章 主要結(jié)論與展望92-94
• 9.1 結(jié)論92
• 9.2 創(chuàng)新點(diǎn)92-93
• 9.3 展望93-94
• 參考文獻(xiàn)94-113
• 綜述113-118
• 參考文獻(xiàn)116-118
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文118-119
• 致謝119

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：890133