本文關(guān)鍵詞：蝦青素在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)氣道上皮MUC5AC高分泌中的作用

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【摘要】：背景：氣道黏液高分泌是慢性氣道疾病的重要病理特征。黏蛋白是維持氣道黏液黏彈性的主要成分,MUC5AC是病理狀態(tài)下氣道主要的分泌蛋白。吸煙是慢性氣道疾病主要危險因素。香煙中活性氧激活EGFR,順次激活下游信號通路,誘導(dǎo)黏蛋白MUC5AC高表達(dá)。蝦青素是類胡蘿卜素的一種,具有極強(qiáng)的抗氧化活性,可以清除氧自由基,抑制ROS的產(chǎn)生�；赗OS在氣道黏蛋白MUC5AC高分泌中的作用及蝦青素的抗氧化活性,我們探討蝦青素對香煙煙霧提取物誘導(dǎo)氣道黏蛋白MUC5AC的作用。 目的：探討蝦青素對香煙煙霧提取物誘導(dǎo)氣道黏蛋白MUC5AC高分泌的作用及相關(guān)機(jī)制。 方法：(1)體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,利用香煙煙霧提取物構(gòu)建氣道黏蛋白MUC5AC高分泌模型。MTT法檢測蝦青素對于細(xì)胞增殖的影響,確定蝦青素的濃度。給予不同濃度的香煙煙霧提取物.(2.5%、5%、10%)刺激A549細(xì)胞24小時,采用RT-PCR檢測MUC5ACmRNA變化,ELISA檢測MUC5AC蛋白變化。確定構(gòu)建模型成功后,將細(xì)胞分為5組：陰性對照組、模型組、模型+8uM ATX組、模型+16uM ATX組、模型+32uM ATX組；分別采用RT-PCR法及ELISA法檢測MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)情況。(2)將細(xì)胞分為5組：陰性對照組、模型組、模型+ATX (32uM)組、模型+DMTU (20uM)組、模型+ATX+DMTU組。多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS變化、RT-PCR檢測MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄變化,ELISA法檢測MUC5AC蛋白表達(dá)變化,Western blot法檢測EGFR、p-EGFR變化。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建香煙煙霧提取物誘導(dǎo)氣道黏蛋白MUC5AC高分泌模型；不同濃度香煙煙霧提取物刺激A549細(xì)胞24小時后,MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)增加,且呈濃度依賴性。MTT結(jié)果顯示,蝦青素濃度低于32uM時對于細(xì)胞增殖作用較弱,當(dāng)蝦青素濃度達(dá)到64uM時,細(xì)胞增殖抑制率超過50%,所以選擇8uM、16uM.32uM三個濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。不同濃度蝦青素干預(yù)后可以明顯降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)。(2)與模型組相比,蝦青素(32uM)干預(yù)組可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量,Western blot結(jié)果顯示EGFR、p-EGFR含量也明顯降低。 結(jié)論：(1)香煙煙霧提取物可以刺激氣道上皮細(xì)胞MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),而蝦青素可以降低香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)(2)蝦青素降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的MCU5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)可能是通過抑制ROS產(chǎn)生,抑制EGFR磷酸化發(fā)揮作用的。
【關(guān)鍵詞】：香煙煙霧提取物 黏蛋白 蝦青素 MUC5AC
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• ~.略語表11-12
• 1 前言12-14
• 2 材料和方法14-28
• 2.1 主要儀器14
• 2.2 主要材料14-15
• 2.3 主要試劑15-16
• 2.4 主要試劑的配制方法16
• 2.4.1 MTT工作液的配制16
• 2.4.2 蝦青素溶液的配制16
• 2.4.3 磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制16
• 2.4.4 PCR引物溶液的配制16
• 2.5 實(shí)驗(yàn)方法16-18
• 2.5.1 香煙煙霧提取物的制備16-17
• 2.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和方法17-18
• 2.6 MTT法檢測香煙提取物及蝦青素對于細(xì)胞增殖的影響18-19
• 2.6.1 MTT法檢測香煙煙霧提取物對于細(xì)胞增殖的影響18-19
• 2.6.2 MTT法檢測蝦青素對于細(xì)胞增殖的影響19
• 2.7. 細(xì)胞處理及分組19-20
• 2.7.1 不同濃度的香煙煙霧提取物刺激A549細(xì)胞19
• 2.7.2 不同濃度的蝦青素干預(yù)分組19-20
• 2.8 蛋白定量20
• 2.9 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中MUC5AC的含量20-21
• 2.10 RT-qPCR檢測細(xì)胞中MUC5ACmRNA含量變化21-23
• 2.10.1 trizol法提取細(xì)胞中總RNA21-22
• 2.10.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA22
• 2.10.3 PCR儀擴(kuò)增22-23
• 2.11. ROS試劑盒檢測ROS23
• 2.11.1 實(shí)驗(yàn)分為5組23
• 2.11.2 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測23
• 2.12. western blot檢測細(xì)胞中EGFR、p-EGFR蛋白表達(dá)情況23-25
• 2.12.1 實(shí)驗(yàn)分組同上,處理完成后提取蛋白23-24
• 2.12.2 蛋白定量：同前24
• 2.12.3 電泳24
• 2.12.4 轉(zhuǎn)膜24-25
• 2.12.5 封閉25
• 2.12.6 一抗孵育25
• 2.12.7 二抗孵育25
• 2.12.8 顯影25
• 2.13 試驗(yàn)流程圖25-27
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)分析27-28
• 3 結(jié)果28-35
• 3.1 不同濃度香煙煙霧提取物,在不同時間對于細(xì)胞增殖的影響28
• 3.2 不同濃度蝦青素刺激細(xì)胞24小時對于細(xì)胞增殖的影響28-29
• 3.3 不同濃度香煙煙霧提取物溶液對于MUC5ACmRNA及蛋白分泌的影響29-31
• 3.4 不同濃度蝦青素對香煙煙霧提取物誘導(dǎo)黏蛋白MUC5AC高分泌的影響31-32
• 3.5 蝦青素及DMTU抑制CSE誘導(dǎo)氣道粘蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)32
• 3.6 蝦青素對香煙煙霧提取物刺激A549細(xì)胞24h后ROS含量變化的影響32-33
• 3.7 蝦青素對香煙煙霧提取物刺激細(xì)胞24后EGFR、p-EGFR蛋白變化的影響33-35
• 4 討論35-37
• 4.1 氣道黏液高分泌模型的建立35
• 4.2 蝦青素對于香煙煙霧提取物誘導(dǎo)氣道黏蛋白MUC5AC高分泌具有抑制作用35-36
• 4.3 蝦青素通過ROS/EGFR通路抑制CSE誘導(dǎo)的A549細(xì)胞MUC5AC高分泌36-37
• 5 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 綜述42-53
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：798216