發(fā)布時間：2020-10-12 23:34

　　 背景和目的:“肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)表型轉(zhuǎn)換”是肝肺綜合征((hepatopulmonary syndrome,HPS)進(jìn)程中重要病理生理改變之一。HPS是慢性肝病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,以肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張、動脈血氧和作用異常為主要表現(xiàn)。因為既往診斷標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一,肝肺綜合征在肝硬化患者中的發(fā)病率從4%到47%不等,確診后2.5年死亡率達(dá)到了41%。因為對肝肺綜合征具體發(fā)病機(jī)制還不是太清楚,目前尚缺乏有效的治療藥物,原位肝移植被認(rèn)為是唯一有效的治療方式。過去的研究已經(jīng)表明肺血管重塑在肝肺綜合征發(fā)病機(jī)制中扮演了重要作用。在肺血管重塑發(fā)展過程中,肺動脈平滑肌細(xì)胞由靜止型(收縮型)向合成型(分泌型)轉(zhuǎn)化;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞向平滑肌樣細(xì)胞分化是兩個基本的病理生理改變。因此,明確肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,可以進(jìn)一步促進(jìn)我們對肝肺綜合征的了解。膜聯(lián)蛋白A2(Annexins A2,ANXA2)是鈣依賴磷酸結(jié)合蛋白超家族的一員。在許多惡性腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖,遷移,骨架形成,血管生成,例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌。目前我們的研究表明,ANXA2在肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中起了重要作用。Micro RNAs(miRNAs),是一種小非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過程。在肺血管重塑的發(fā)展進(jìn)程中,某些特定階段mi RNAs的表達(dá)參與PASMCs表型轉(zhuǎn)化在其中發(fā)揮著重要的作用。鑒于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控ANXA2表達(dá)的作用并不明顯,我們推測是否存在潛在的mi RNAs通過調(diào)節(jié)ANXA2基因的表達(dá)參與了肺動脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。方法:實驗分五部分1.構(gòu)建HPS大鼠模型并制備血清,培養(yǎng)原代PASMCs采用慢性膽總管結(jié)扎構(gòu)建HPS大鼠模型,2周后行病理切片及血氣分析,成功后制備血清。采用組織塊法培養(yǎng)原代PASMCs。2.生物信息學(xué)分析,HPS大鼠血清刺激PASMCs后對SMα-actin、ANXA2和miRNA-206表達(dá)進(jìn)行檢測生物信息學(xué)分析預(yù)測可能靶向作用于ANXA2 3′-UTR的miRNAs。PASMCs隨機(jī)分為2組:對照組(C組)和HPS干預(yù)組(HPS組),分別接受5%正常大鼠血清或HPS大鼠血清孵育24、48和72h后,采用western blot法分別檢測ANXA2,SMα-actin表達(dá);q RT-PCR檢測ANXA2 mRNA和mi RNAs的表達(dá)。3.PASMCs轉(zhuǎn)染以及ANXA2,SMα-actin的免疫熒光檢測PASMCs分別轉(zhuǎn)染miR-206 mimic,mi R-206 inhibitor或ANXA2過表達(dá)質(zhì)粒。采用western blot法分別檢測ANXA2,SMα-actin表達(dá),及采用免疫熒光對ANXA2,SMα-actin細(xì)胞內(nèi)定位。q RT-PCR檢測ANXA2 m RNA的表達(dá)。4.雙熒光素酶報告基因檢測雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-206是否通過直接結(jié)合到ANXA2mRNA的3′-UTR,抑制ANXA2的表達(dá)。5.3H-Thymidine(3H-TdR)摻入法和CCK-8法檢測將mi R-206 mimic和(或)ANXA2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肺動脈平滑肌細(xì)胞,3H-TdR摻入法和CCK-8法觀察其對HPS大鼠血清刺激導(dǎo)致的增殖效應(yīng)的影響。結(jié)果:1.HPS大鼠血清對肺動脈平滑肌細(xì)胞miR-206 and ANXA2的影響。生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測miRNA-206可以結(jié)合到ANXA2基因的3′-UTR。在肝肺綜合征大鼠血清刺激組,miR-206與ANXA2的表達(dá)在不同的時間點呈負(fù)相關(guān)。2.miR-206調(diào)節(jié)PASMCs表型轉(zhuǎn)化。PASMCs在轉(zhuǎn)染miR-206 mimic,miR-206 inhibitor后,表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白SMα-actin與miR-206的表達(dá)水平呈正相關(guān)。3.miR-206直接結(jié)合ANXA2 m RNA 3′-UTR抑制ANXA2表達(dá)。miRNA功能分析和熒光素酶報告基因檢測表明,mi RNA通過直接結(jié)合到ANXA2mRNA的3′-UTR,抑制ANXA2的表達(dá)。4.miR-206/ANXA2通路介導(dǎo)HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和增殖。mi R-206有效的抑制了HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖。然而,這種效應(yīng)可以在過表達(dá)ANXA2的情況下逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:本研究表明miR-206通過下調(diào)ANXA2基因表達(dá),抑制了HPS大鼠血清刺激的PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和增殖。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R575;R563
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
    1.1 選題緣由
    1.2 研究背景
    1.3 研究意義
    1.4 研究內(nèi)容
    1.5 研究方法
第二章 肝肺綜合征大鼠血清對PASMCs表型轉(zhuǎn)化的影響
    2.1 肝肺綜合征大鼠血清對PASMCs表型轉(zhuǎn)化的影響
        2.1.1 實驗材料與方法
        2.1.2 結(jié)果
        2.1.3 討論
第三章 調(diào)控ANXA2的miRNA預(yù)測研究及初步檢測
    3.1 調(diào)控ANXA2的miRNA預(yù)測研究及初步檢測
        3.1.1 實驗材料和方法
        3.1.2 結(jié)果
        3.1.3 討論
第四章 miR-206/ANXA2在肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用研究
    4.1 miR-206在PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用
        4.1.1 實驗材料與方法
        4.1.2 結(jié)果
        4.1.3 討論
    4.2 miR-206靶向結(jié)合ANXA2 m RNA 3′-UTR抑制ANXA2表達(dá)
        4.2.1 實驗材料與方法
        4.2.2 結(jié)果
        4.2.3 討論
    4.3 miR-206/ANXA2在肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用研究
        4.3.1 實驗材料與方法
        4.3.2 結(jié)果
        4.3.3 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述micro RNA對血管重建中VSMC功能調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
致謝

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