背景及目的慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)肺泡巨噬細(xì)胞(AM)吞噬功能降低且與細(xì)胞骨架異常重排有關(guān)。Toll樣受體(TLR)4可能通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Rac)1信號(hào)通路參與AM細(xì)胞骨架重排及吞噬過(guò)程,且國(guó)內(nèi)外研究罕見(jiàn)。直接體內(nèi)獲取原代AM并進(jìn)行傳代較為困難,且不易進(jìn)行RNA干擾(RNAi)等技術(shù)干預(yù),小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7保留巨噬細(xì)胞吞噬及粘附功能,可穩(wěn)定傳代并可進(jìn)行RNAi等技術(shù)干預(yù)。故本研究選用RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象,探討TLR4-PI3K-Rac1信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞骨架重排及吞噬功能中的作用。方法RAW264.7細(xì)胞分為空白組、陰性對(duì)照組及TLR4-RNAi組。構(gòu)建3個(gè)攜帶TLR4基因短發(fā)卡RNA(shRNA)的質(zhì)粒及1個(gè)攜帶無(wú)意義shRNA序列的陰性對(duì)照質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞。篩選轉(zhuǎn)染效率最高的一條TLR4-shRNA,將TLR4-shRNA及無(wú)意義對(duì)照序列shRNA進(jìn)行慢病毒包裝,將攜帶TLR4-shRNA及攜帶無(wú)意義對(duì)照序列的慢病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染至TLR4-RNAi組及陰性對(duì)照組,空白組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)TLR4基因沉默效率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、Rac1 mRNA的表達(dá),Western blot測(cè)各組細(xì)胞PI3K、磷酸化Rac1(p-Rac1)、Rac1蛋白表達(dá);激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞吞噬異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌(FITC-E.coli)的能力,用平均熒光強(qiáng)度(MFI)和吞噬細(xì)胞百分比(吞噬%)表示。結(jié)果(1)轉(zhuǎn)染效率及沉默效率檢測(cè):TLR4-shRNA質(zhì)粒及慢病毒可成功轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率大于80%,TLR4基因沉默效率為(63?4)%;(2)各組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá):TLR4-RNAi組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)(0.20?0.03、0.37?0.04)均低于空白組和陰性對(duì)照組[(1.00?0.00、1.00?0.05)和(0.98?0.09、0.97?0.07)](均P0.01);陰性對(duì)照組和空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)各組PI3K mRNA和蛋白表達(dá):TLR4-RNAi組PI3K mRNA和蛋白表達(dá)(0.64?0.06、0.75?0.06)均低于空白組和陰性對(duì)照組[(1.00?0.00、1.00?0.08)和(0.98?0.05、1.00?0.09)](均P0.01);陰性對(duì)照組和空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(4)各組Rac1 mRNA和蛋白表達(dá):TLR4-RNAi組Rac1 mRNA、蛋白和p-Rac1蛋白表達(dá)(0.75?0.04、0.76?0.01、0.74?0.05)均低于空白組和陰性對(duì)照組[(1.00?0.00、1.02?0.05、1.00?0.06)和(0.96?0.10、1.07?0.09、1.00?0.06)](均P0.01),陰性對(duì)照組和空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(5)細(xì)胞骨架變化:TLR4-RNAi組RAW264.7細(xì)胞偽足伸出短少、僵硬,細(xì)胞內(nèi)吞噬的FITC-E.coli較少,空白組和陰性對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞偽足伸出良好,吞噬的FITC-E.coli較多。(6)各組細(xì)胞吞噬FITC-E.coli能力:TLR4-RNAi組MFI和吞噬%[(7453?564)、(70.20?2.27)%]均低于空白組和陰性對(duì)照組[(11733?935)、(79.97?1.07)%和(10983?954)、(79.60?1.17)%](均P0.01),陰性對(duì)照組MFI和吞噬%與空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)相關(guān)性分析:基礎(chǔ)狀態(tài)下及RNAi干預(yù)后TLR4 mRNA和蛋白與PI3K、Rac1 mRNA和蛋白及p-Rac1蛋白均呈正相關(guān)(均P(27)0.05),基礎(chǔ)狀態(tài)下及RNAi干預(yù)后,PI3K mRNA、蛋白表達(dá)與Rac1 mRNA、蛋白及p-Rac1蛋白均呈正相關(guān)(均P(27)0.05),基礎(chǔ)狀態(tài)下及RNAi干預(yù)后,TLR4、PI3K、Rac1 mRAN和蛋白及p-Rac1蛋白與MFI、吞噬%均呈正相關(guān)(均P(27)0.05)。結(jié)論TLR4-shRNA質(zhì)粒和慢病毒可成功轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,沉默TLR4基因;TLR4-PI3K-Rac1信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬功能;沉默TLR4基因可以抑制PI3K-Rac1信號(hào)通路,使巨噬細(xì)胞骨架排列紊亂、吞噬功能降低。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R563.9
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 TLR4-PI3K-Rac1 通路對(duì)巨噬細(xì)胞骨架及吞噬功能的影響ΔCt(其它組)=Ct(其它組目的基因)-Ct(內(nèi)參)ΔΔCt=ΔCt(其它組)-ΔCt(空白組)

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 TLR4-PI3K-Rac1 通路對(duì)巨噬細(xì)胞骨架及吞噬功能的影響ΔCt(其它組)=Ct(其它組目的基因)-Ct(內(nèi)參)ΔΔCt=ΔCt(其它組)-ΔCt(空白組)圖 1 實(shí)驗(yàn)樣品中 TLR4 的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)

圖 4 蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)-PAGE 凝膠電泳膠前，準(zhǔn)備所用器械及儀器，先用自來(lái)水徹底沖洗玻璃水洗滌一遍，擦拭晾干后將玻璃板卡在夾子上，進(jìn)行檢水注入夾子中的兩塊玻璃板之間，記錄液面高度，等待否下降，如玻璃板無(wú)液體漏出，即可進(jìn)行下一步配膠操膠：根據(jù)所測(cè)基因大小選擇合適濃度的分離膠，因此需分離膠各一塊(表 3)，因 AP 和 TEMED 會(huì)使膠迅速凝固TEMED 且加入后立即快速搖勻，用移液槍吸取凝膠注入面接近刻度時(shí)，應(yīng)減慢注膠速度，保證凝膠液面水平，注滿(mǎn)水，液封的膠凝固速度快；約 10min 后，在分離膠與，表示膠已凝固。膠：待分離膠膠自然凝固后，徹底棄去玻璃板中的水；；配置完成后，用移液槍吸取濃縮膠加入玻璃板中，使其
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本文編號(hào)：2838067