COPD是慢性氣道疾病,與有毒顆粒和氣體引起的肺組織異常炎性反應有關,導致氣流受限不完全可逆的肺氣腫。COPD是全世界死亡率的第5位因素,而且COPD的患病率和死亡率有逐年上升的趨勢。目前對COPD發(fā)病機制的觀點是香煙刺激物誘導炎性細胞的聚集,炎性細胞釋放活性氧和蛋白水解酶,引起肺基質的毀損和結構細胞的死亡。最近的研究認為肺組織結構細胞的凋亡可能在COPD的發(fā)病機制中有很重要的作用。對COPD病人肺組織切片的研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞和內皮細胞的凋亡增加,而這些結構細胞的增殖并沒有均衡的增加,因而可促進肺組織的毀損和肺氣腫的發(fā)生。而且在嚴重的COPD動物模型中發(fā)現(xiàn),在肺氣腫的發(fā)展中顯著缺乏炎性細胞。動物實驗證明即使沒有炎性細胞的聚集,肺泡壁細胞或內皮細胞凋亡也足夠引起肺氣腫的發(fā)生。越來越多的證據(jù)證明了炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化應激與凋亡相互作用導致COPD發(fā)病的復雜性。因此有待于進一步研究在COPD發(fā)病過程中凋亡的途徑,以及進一步評估是否抗凋亡或再生可以成為阻止疾病進一步惡化的靶點。在健康肺組織的毀損過程中凋亡和再生失衡現(xiàn)象也提示應用干細胞治療肺氣腫疾病的可能。 最近干細胞的研究使組織損傷和再生的傳統(tǒng)治療觀點帶來了新的希望。實驗發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞(MSCs)有迅速增殖的潛能,MSCs來源的細胞可以分化為間充質組織,例如骨、軟骨、肌肉以及非間充質組織,如內皮細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞。心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)學科在干細胞的研究中有很大的突破,但是由于呼吸系統(tǒng)結構和功能的復雜性,呼吸干細胞的研究發(fā)展很慢。Ortiz報道了骨髓來源干細胞可能減輕博來霉素誘導的肺纖維化,第一次提出骨髓來源的干細胞對肺組織疾病具有顯著效果。近年來關于干細胞對肺損傷的研究逐漸開展起來,爭議眾多,焦點在于MSCs是否對損傷肺組織有修復作用以及分化為哪種類型的肺組織細胞。 骨髓干細胞在肺內分化能力和作用的報道各異。Hashimoto移植表達EGFP的MSC/HSC到博來霉素誘導的肺纖維化小鼠,引起大量的GFP陽性細胞遷移到達纖維變性的損傷區(qū),提示許多成纖維細胞來源于骨髓來源的前體細胞。Mauricio Rojas應用博來霉素和白消安處理的肺損傷模型,在GFP- MSCs移植后,發(fā)現(xiàn)肺內GFP陽性細胞可以分化為I型肺泡上皮細胞、II型肺泡上皮細胞、成纖維細胞、肌纖維母細胞和內皮細胞。但是由于試驗方法和技術的不同,如骨髓干細胞的提取、肺損傷的方法、移植物在組織中的檢測方法不同,眾多實驗小組的研究結果不同,檢測到HSC/MSC在肺內分化為不同類型的細胞。目前肺損傷后移植干細胞的量、時機以及干細胞在肺內的修復作用還沒有明確的肯定。 骨髓MSCs不僅具有分化能力還有分泌功能,能夠分泌多種細胞因子例如白介素(IL)-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15以及白血病抑制因子(LIF)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細胞因子、血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等。Chen等報道通過尾靜脈注射骨髓基質細胞到腦缺血大鼠,可以促進成纖維細胞生長因子的表達,減少腦缺血部位細胞的凋亡,改善腦缺血大鼠的腦功能恢復。Kocher等報道移植造血干細胞可改善心肌梗死周邊區(qū)肥大心肌細胞的凋亡。因此提出干細胞不僅具有分化作用,也可以通過一些途徑抑制損傷部位細胞凋亡的發(fā)生。 MSCs移植對肺氣腫是否有修復作用,在肺內可以分化為哪種類型的結構細胞,在肺組織微循環(huán)的作用下分泌哪些細胞因子,是否也同樣具有抗細胞凋亡作用,抗凋亡的途徑是什么,目前還鮮見報道。因此我們應用MSCs移植到木瓜蛋白酶和鈷60照射誘導的肺氣腫模型中,探討肺氣腫形成的機制以及MSCs移植對肺損傷修復作用的機制,為干細胞治療肺氣腫疾病的可能提供實驗依據(jù)。 第一部分大鼠骨髓間充質干細胞體外分化能力的鑒定 目的:建立體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的方法,觀察MSCs的生物學性狀,為進一步研究提供實驗依據(jù)。 方法:取2月齡大鼠骨髓,經(jīng)密度梯度離心后取單個核細胞層接種,保留貼壁細胞傳代,觀察細胞生長情況,測定生長曲線,流式細胞儀進行MSCs表型測定和細胞周期分析。檢測細胞向成骨、成脂細胞分化情況。 結果:從大鼠骨髓中培養(yǎng)的MSCs具有體外擴增和多向分化潛能。 結論:建立了體外分離純化MSCs的方法,驗證了MSCs體外分化潛能,可作為組織工程種子細胞的可行性。 第二部分放射損傷對于移植的骨髓間充質干細胞在受體大鼠不同器官中植入的影響 目的:探討放射損傷對于骨髓間充質干細胞(MSCs)移植后在受體大鼠不同器官中植入的影響以及可能的機制。 方法:采用TUNEL法檢測正常對照組和單純放射組大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟的細胞凋亡率。應用密度梯度離心法結合貼壁法提取雄性大鼠骨髓MSCs,培養(yǎng)后把MSCs移植到60COγ照射和未經(jīng)照射的雌性大鼠體內,通過PCR和Y染色體熒光原位雜交(Y- FISH)示蹤雄性大鼠MSCs在雌性大鼠體內的分布情況。 結果:照射后大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟細胞凋亡率顯著高于對照組。PCR結果顯示照射后移植MSCs的大鼠心臟、腎臟、肝臟、肺臟和外周血中可以擴增出Sry基因的DNA序列,而且Y- FISH顯示照射后移植MSCs的大鼠在心臟、腎臟、肝臟、肺臟中可發(fā)現(xiàn)Y染色體陽性的細胞。但是未經(jīng)照射行MSCs移植的大鼠在上述器官中未發(fā)現(xiàn)Y染色體陽性的細胞。 結論:全身放射促進組織細胞的凋亡,并導致移植的MSCs在受體大鼠心臟、腎臟、肝臟和肺臟的植入。 第三部分肺泡壁細胞的凋亡參與木瓜蛋白酶所致大鼠肺氣腫的形成 目的:觀察木瓜蛋白酶所致的肺氣腫大鼠肺泡壁細胞凋亡,探討細胞凋亡在肺氣腫發(fā)病中的作用。 方法:大鼠隨機分為3組:正常對照組,木瓜蛋白酶組,木瓜蛋白酶和鈷60處理組。觀察肺組織病理學變化,TUNEL法檢測大鼠肺泡壁凋亡細胞,免疫組化法檢測肺泡壁細胞PCNA、Bax和SP-C蛋白的表達。TUNEL與SP-C免疫熒光法鑒定凋亡細胞中的II型肺泡上皮細胞。 結果:木瓜蛋白酶組、木瓜蛋白酶和鈷60處理組大鼠出現(xiàn)明顯肺氣腫改變。木瓜蛋白酶和鈷60處理組平均內襯間隔、平均肺泡面積和單位面積肺泡數(shù)與木瓜蛋白酶組比較有顯著性差異。木瓜蛋白酶組、木瓜蛋白酶和鈷60處理組大鼠肺泡壁細胞的AI、PI以及Bax染色陽性的細胞百分比顯著高于正常對照組;而SP-C染色陽性的細胞百分比顯著低于正常對照組。木瓜蛋白酶和鈷60處理組大鼠的AI、PI、Bax染色陽性的細胞百分比顯著高于木瓜蛋白酶組;而SP-C染色陽性的細胞百分比顯著低于木瓜蛋白酶組。肺氣腫改變組中一些TUNEL陽性細胞表達II型肺泡上皮細胞標志SP-C。 結論:大鼠肺泡壁細胞特別是II型肺泡上皮細胞凋亡參與肺氣腫的形成,Bax蛋白的表達上調可能是導致肺氣腫大鼠肺泡壁細胞的凋亡的原因之一。 第四部分骨髓間充質干細胞移植改善木瓜蛋白酶和鈷60照射所致的大鼠肺氣腫改變 目的:觀察大鼠骨髓間充質干細胞移植對木瓜蛋白酶和鈷60照射所致的肺氣腫大鼠肺泡壁細胞的凋亡以及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響,骨髓MSCs移植后在受體肺組織中的植入和分化情況,探討骨髓MSCs移植改善木瓜蛋白酶和鈷60照射所致肺氣腫的機制。 方法:雌性大鼠隨機平均分為三組:正常對照組、肺氣腫組、肺氣腫+MSCs移植組。利用木瓜蛋白酶氣管內滴入和鈷60照射誘導雌性大鼠肺氣腫模型的建立,然后將培養(yǎng)的雄性大鼠MSCs經(jīng)尾靜脈注射到雌性肺氣腫大鼠。觀察移植28d后肺組織形態(tài)學變化,采用TUNEL法檢測肺泡壁細胞的凋亡,免疫組化法檢測Bcl-2蛋白、Bax蛋白在肺泡壁細胞中的表達。通過PCR和Y染色體熒光原位雜交(Y- FISH)示蹤雄性大鼠MSCs在雌性肺氣腫大鼠肺組織內的植入情況;用Y-FISH和肺泡表面活性物質蛋白C(SP-C)免疫熒光顯色方法檢測雄性大鼠MSCs在受體肺組織內是否分化為II型肺泡上皮細胞。 結果:肺氣腫組、肺氣腫+MSCs移植組大鼠出現(xiàn)肺氣腫改變,但肺氣腫+MSCs移植組大鼠肺組織的肺氣腫改變較肺氣腫組減輕;肺氣腫組平均內襯間隔、平均肺泡面積和單位面積肺泡數(shù)與肺氣腫+MSCs移植組比較有顯著性差異;TUNEL結果顯示肺泡壁細胞凋亡指數(shù)在肺氣腫組和肺氣腫+MSCs移植組大鼠明顯高于正常對照組,肺氣腫+MSCs移植組肺泡壁細胞凋亡指數(shù)明顯低于肺氣腫組(P0.01);免疫組化結果顯示肺氣腫+MSCs移植組Bcl-2染色陽性細胞百分比高于肺氣腫組(P0.01),肺氣腫+MSCs移植組Bax染色陽性細胞百分比明顯低于肺氣腫組(P0.01),肺氣腫+MSCs移植組Bcl-2/Bax比值高于肺氣腫組。PCR結果顯示肺氣腫+MSCs移植組的大鼠肺臟基因組DNA中可以擴增出位于Y染色體的Sry基因片斷;Y-FISH顯示肺氣腫+MSCs移植組的雌性大鼠肺組織中有Y染色體陽性的細胞;Y-FISH和SP-C熒光免疫組化結果顯示肺氣腫+MSCs移植組的雌性大鼠肺組織中的部分Y染色體陽性細胞同時表達SP-C。 結論:骨髓MSCs移植能夠減輕木瓜蛋白酶和鈷60照射所致肺氣腫改變,可能與骨髓MSCs移植抑制肺氣腫大鼠肺泡壁細胞的凋亡,移植的MSCs在受體肺組織中的植入和分化為II型肺泡上皮細胞有關。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R563.3
【部分圖文】：

7圖1 培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs（10天后）圖2 細胞周期分析結果 圖3 MSCs細胞表面分子標志鑒定圖 4 油紅 O 檢測脂肪滴 圖 5 Von Kossa 染色鑒定圖6 改良GOmorI氏鈣鈷法鑒定

7圖1 培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs（10天后）圖2 細胞周期分析結果 圖3 MSCs細胞表面分子標志鑒定圖 4 油紅 O 檢測脂肪滴 圖 5 Von Kossa 染色鑒定圖6 改良GOmorI氏鈣鈷法鑒定

MSCs細胞表面分子標志鑒定
【引證文獻】

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1 周雪原;大鼠骨髓間充質干細胞對不育大鼠生殖系統(tǒng)修復作用的研究[D];內蒙古大學;2012年

本文編號：2837591