目的及意義:ALI/ARDS是戰(zhàn)時(shí)及日常臨床工作中常見的危重癥之一。過去10-15年ALI/ARDS的病死率有所下降,但仍高達(dá)40 %。目前,對(duì)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,臨床上缺乏特效治療方法,現(xiàn)仍以對(duì)癥和支持治療為主要手段。故研究新的治療策略是臨床學(xué)家所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。FLIP是一種細(xì)胞凋亡的抑制蛋白,它在結(jié)構(gòu)和序列上與caspase-8具有同源性,但由于在caspase-8中起催化作用的兩個(gè)氨基酸殘基Cys、His分別被Tyr、Arg所替代,從而使FLIP喪失了蛋白水解酶活性。FLIP可以與caspase-8競爭性結(jié)合FADD,阻斷DISC的組裝,從而抑制細(xì)胞凋亡。近年來,普遍認(rèn)為ALI/ARDS是嚴(yán)重創(chuàng)傷和膿毒癥等引發(fā)的過度炎癥反應(yīng)。多形核白細(xì)胞(PMN)、AEC、PVEC等多種細(xì)胞及細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)參與了ALI/ARDS的發(fā)病過程。其中, AEC、PVEC凋亡引起的呼吸膜通透性增高,在ALI/ARDS的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell,AEC)、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)凋亡在ALI/ARDS發(fā)病中的重要地位,利用FLIP競爭性抑制caspase-8的特點(diǎn),通過AdMax系統(tǒng)構(gòu)建FLIP重組體腺病毒感染Ⅱ型AEC、PVEC,從而抑制其凋亡,阻斷ALI/ARDS的發(fā)病進(jìn)程,本實(shí)驗(yàn)研究將為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。 方法 1.構(gòu)建FLIP重組體腺病毒:根據(jù)Ⅱ型AEC、PVEC凋亡在ALI/ARDS發(fā)病中的重要地位,利用FLIP可競爭性抑制caspase-8,阻斷DISC形成,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),通過含有大鼠FLIP全長基因的原始載體及AdMax腺病毒包裝系統(tǒng),構(gòu)建FLIP重組體腺病毒Ad-FLIP,包裝產(chǎn)生出病毒后,經(jīng)EcoRI+NheI雙酶切及PCR鑒定構(gòu)建是否正確,后擴(kuò)增病毒,測(cè)定病毒滴度; 2.培養(yǎng)并感染大鼠Ⅱ型AEC(購于ATCC):根據(jù)測(cè)定Ad-FLIP的MOI值感染大鼠Ⅱ型AEC,感染24 h后,通過RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染組及各對(duì)照組Ⅱ型AEC中FLIP的mRNA及蛋白表達(dá),比較有無差異;通過細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組Ⅱ型AEC發(fā)生凋亡,通過流式細(xì)胞儀分析兩組細(xì)胞間早中期凋亡率的差別,隨后經(jīng)western blot方法分析凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)變化;四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)并比較兩組細(xì)胞活性,分光光度計(jì)法檢測(cè)并比較兩組細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活力; 3.培養(yǎng)并感染大鼠PVEC:采用大鼠經(jīng)典原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)大鼠PVEC,原代培養(yǎng)的大鼠PVEC經(jīng)光鏡觀察及Ⅷ因子間接免疫熒光鑒定培養(yǎng)是否成功。根據(jù)測(cè)定Ad-FLIP的MOI值感染大鼠PVEC,感染24 h后,通過RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染組及各對(duì)照組PVEC中FLIP的mRNA及蛋白表達(dá),比較有無差異。隨后,通過細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組PVEC發(fā)生凋亡,通過流式細(xì)胞儀分析感染組及對(duì)照組間早中期凋亡率的差別。 結(jié)果 1.利用含有大鼠FLIP全長基因的原始載體及Ad-Max腺病毒包裝系統(tǒng),包裝出含有大鼠FLIP基因的腺病毒Ad-FLIP,經(jīng)EcoRI+NheI雙酶切及PCR鑒定復(fù)合預(yù)期結(jié)果,構(gòu)建正確;測(cè)定病毒滴度v.p./mL:2.3×10~(11) ,TCID50/ml:7.1×10~9; 2.重組腺病毒Ad-FLIP感染大鼠Ⅱ型AEC24h后,經(jīng)RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組Ⅱ型AEC發(fā)生凋亡,通過流式細(xì)胞儀分析Ad-FLIP感染組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(p0.05)。同時(shí)MTT結(jié)果提示,CH-11對(duì)兩組細(xì)胞的活力均有抑制作用,且呈濃度依賴性,但感染組細(xì)胞較對(duì)照組有明顯的抵抗(p0.05)。CH-11提高兩組細(xì)胞caspase-3的活力,但FLIP可抑制caspase-3的活化(p0.05)。Western blot結(jié)果顯示,FLIP可以抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá); 3.重組腺病毒Ad-FLIP感染大鼠PVEC24h后,經(jīng)RT-PCR及western blot方法檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)FLIP的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加。細(xì)胞毒性Fas單克隆抗體(CH-11)誘導(dǎo)感染組及對(duì)照組PVEC發(fā)生凋亡,通過流式細(xì)胞儀分析Ad-FLIP感染組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(p0.05)。 結(jié)論 采用含有大鼠FLIP基因的重組體腺病毒Ad-FLIP分別感染大鼠Ⅱ型AEC、PVEC,可以顯著提高其對(duì)Fas單克隆抗體誘導(dǎo)凋亡的抗性。FLIP抑制凋亡可能通過抑制細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性以及凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R563.8
【部分圖文】：

－1FLIP原始質(zhì)粒PCR鑒定圖

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 1－1 FLIP 原始質(zhì)粒 PCR 鑒定圖2重組質(zhì)粒pDC316-FLIP鑒定PCR 鑒定應(yīng)能獲得 1.4 kb 的條帶，電泳圖譜與預(yù)期相符(圖 1－2)。

重組質(zhì)粒 pDC316-FLIP 經(jīng) EcoRI+NheI 雙酶切鑒EXU-F測(cè)序結(jié)果：TCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGACTGAGCACTGTGTCTGCTGAGGTCATTTGATGAGGATGAGAAGGAGATGATGCTTGAGAACCTGGCTCCACCCAACGTCAGTGAGAGAGGCCAGCTCTCCTTCGCTGCGGTGCGGCGGTTTGACCTGCTCAAGACAGCGGTGGAGGACCATCTGTGCAGAATAGGGTGCTGCTGATGGAGATTGGGGATCCTCCTTAATTTTCCTTACAAAGGATT

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 錢桂生;急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征研究現(xiàn)狀與展望[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2003年02期

本文編號(hào)：2834967