目的克隆人血管生成素1基因(hAng1),采用AdMax包裝系統(tǒng)構(gòu)建含人血管生成素1的重組腺病毒質(zhì)粒,為研究血管生成素1對急性肺損傷中炎癥消退的作用奠定基礎(chǔ)。方法將hAng1 cDNA克隆于真核表達載體pDC315-EGFP,得到重組質(zhì)粒pDC315-EGFP-Ang1,采用位點特異性重組系統(tǒng)(Cre/Loxp)將pDC315-EGFP-Angl與pBHG lox△E1,3Cre輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞,生成帶有Angl基因的重組腺病毒載體Ad-EGFP-Ang1,重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細胞中擴增,氯化銫梯度離心純化。檢測轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中以及細胞培養(yǎng)上清中的Ang1蛋白表達。結(jié)果經(jīng)酶切鑒定和測序證實載體構(gòu)建的正確性,病毒滴度為1.5×1012 PFU·mL-1。Ad-EGFP-Ang1轉(zhuǎn)染的HEK293細胞和細胞培養(yǎng)上清中均檢測出Ang1蛋白。結(jié)論帶有hAng1 cDNA的重組腺病毒載體構(gòu)建成功,可用于對急性肺損傷炎癥消退的影響的研究。 目的氣管滴入脂多糖復(fù)制小鼠急性肺損傷模型,為進一步探討炎癥反應(yīng)過程奠定基礎(chǔ)。方法將20只SPF級雄性BALB/c小鼠(20-25g)隨機分為對照組和脂多糖組,每組10只小鼠,麻醉后分別經(jīng)氣管插管滴入生理鹽水(對照組)和脂多糖3mg·kg-1(脂多糖組)。觀察24小時死亡率、肺組織濕干重比、病理改變,肺泡灌洗液中的白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)和總蛋白濃度。結(jié)果脂多糖組小鼠死亡率33.3%,對照組沒有小鼠死亡。脂多糖組肺組織病理評分、肺組織濕干重比、肺泡灌洗液中的白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)和總蛋白濃度均高于對照組,(P=0.001)。結(jié)論氣管滴入脂多糖3 mg·kg-1成功模擬了ALI的過程,是進一步探討炎癥反應(yīng)過程的可靠的ALI動物模型。 目的通過基因轉(zhuǎn)染增加血清中血管生成素1(Angl)的濃度,探討血管生成素1基因治療對急性肺損傷炎癥消退的影響。方法SPF級BALB/c小鼠氣管內(nèi)滴入脂多糖構(gòu)建急性肺損傷動物模型前,經(jīng)尾靜脈注入空載體病毒(Ad-GFP, GFP組)或者攜帶血管生成素1的腺病毒(Ad-GFP-Ag1, Ang1組)。經(jīng)氣管滴入脂多糖后4h、12h、24h、48h、72h、96h處死小鼠,取肺泡灌洗液收集細胞,行細胞計數(shù)分類,并用流式檢測中性粒細胞凋亡和被巨噬細胞吞噬情況。收集肺組織和肝臟組織以及血清,檢測血管生成素1的基因和蛋白表達。檢測肺泡灌洗液中的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子濃度變化。另外取4只小鼠,靜脈注入空載體病毒,24小時后氣管滴入生理鹽水作對照組。結(jié)果LPS氣管滴入后大量的白細胞浸潤到肺組織和肺泡腔,早期以中性粒細胞為主,在48h白細胞和中性粒細胞達到最大值。Angl預(yù)處理增加了angl在肝臟的表達,分泌到血清中,減少了炎性細胞浸潤并促進了中性粒細胞的凋亡和吞噬,從而加速了中性粒細胞從組織的清除,同時,增加了肺泡灌洗液中的粒細胞單核細胞集落刺激因子濃度。結(jié)論血管生成素1預(yù)處理促進了急性肺損傷炎癥消退,這與其促進中性粒細胞的凋亡和巨噬細胞吞噬有關(guān)。 1經(jīng)頸透照明視下完成并證實小鼠氣管插管成功,經(jīng)氣管插管滴入3mg·kg-1脂多糖可以成功復(fù)制ALI模型。 2脂多糖3mg·kg-1氣管滴入后48小時,肺組織炎癥達高峰,隨后進入炎癥消退期。血管生成素1預(yù)處理有效的穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞,減少蛋白滲出,抑制了炎癥細胞組織浸潤。 3血管生成素1促進了急性肺損傷炎癥消退。其機制是血管生成素1通過穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞促進炎癥組織中性粒細胞凋亡,促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞。 4血管內(nèi)皮細胞參與了炎癥消退過程。 5血管內(nèi)皮細胞可能是急性肺損傷防治的一個重要的潛在的靶點。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

材料載體 PDC315一EGFPvector有上海吉凱基因技術(shù)有限公司構(gòu)建。(圖1一l) ITRAd.I.m.nt mCMVPromoter滅五 01(807)OC3，5干AmP五心pR皿歸則〕EGF尸悶M.祝PDC315很圖1一1真核表達載體信息l6

這個系統(tǒng)的工作原理是將攜帶外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒同攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細胞，利用 Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。(圖1一2)AdMax”，ror羅倪ra吸協(xié) norAd亡nov色麟、玫tO“1側(cè)FO曰叫卜司卜燦C代‘牙FLI.△民3腸七I一仁二廠食一黑.A畢吞E..\入記loxl， or介tGe.舊日 nlePl.，nid+Ap’以yr皿A、SE〔.】，書3CFI」求.p種 fnfr.-加二UO. IoxPof介t.1雙悶...獷ror戶甸，DNA杏’0甸“I下只.州卜△ElA助RCCornbin幼 tViralVcCtor圖1一 2AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)(三)輔助包裝質(zhì) 粒:pBHGlox△El， 3Cre輔助包裝質(zhì)粒(叢魚紅劍叢荃.Canad

華中科技大學博士學位論文圖1一6目的質(zhì)粒在HEK293細胞中的熒光表達圖a為細胞白光照片，圖b為細胞熒光照片。放大倍數(shù)200倍。圖1一 7HEK293細胞中Angl蛋白表達泳道說明:WBSTDool為WB標準品，陽性對照Con為293T細胞樣品;KL884一1、一2為目的質(zhì) 粒(PDC315一GFp一Angl)轉(zhuǎn)染293T后樣品。

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本文編號：2829660