發(fā)布時間：2020-09-22 17:03

　　 哮喘是一種以氣道慢性非特異性炎癥為本質的常見疾病,具有氣道黏液過度分泌、氣道高反應性(AHR)、血清IgE增高和氣道嗜酸性粒細胞浸潤等特征。而現在越來越多的研究證實,不同的趨化因子在哮喘發(fā)生的不同階段發(fā)揮著特異性的作用。趨化因子家族控制著白細胞的遷移和激活。根據序列同源性和第一組兩個半胱氨酸殘基的位置,趨化因子主要分為CC和CXC兩大家族[1],哮喘氣道中趨化因子主要來源于肺泡巨噬細胞和哮喘氣道上皮細胞。哮喘時嗜酸性粒細胞的浸潤使得研究主要關注于對其有趨化作用的趨化因子上,例如RANTES/CCL5 ,MCP-4/CCL13, MCP-3/CCL7。而這些趨化因子通過與在嗜酸性粒細胞中高表達的CCR3受體結合而募集嗜酸性粒細胞[2,3]。除了趨化和激活嗜酸性粒細胞外,這些趨化因子還能夠影響其他的與哮喘相關的白細胞,例如TH2細胞,嗜堿性粒細胞等。最近研究表明在哮喘持續(xù)期的患者的肺泡灌洗液(BALF)中MCP-1,CCL3和CCL5顯著升高[4]。我們前期的研究也發(fā)現在卵清蛋白(OVA)激發(fā)的小鼠哮喘模型的肺組織中MCP-1和MCP-3的轉錄高峰在第4小時,且在第8和24小時持續(xù)升高。 Intelectin屬于凝集素家族,分為Intelectin1和Intelectin2,均是在小鼠小腸的Paneth細胞中發(fā)現,Intelectin1和Intelectin2具有91%的同源性。人類Intelectin (hIntL)是一種分泌型糖蛋白,包含295個氨基酸及N-端連接低聚糖,其基本結構單位是120kDa的三聚體,其中40kDa多肽由二硫鍵連接,并且也分為Intelectin1和Intelectin2。研究表明重組的hIntL在Ca~(2+)存在時可以結合D-戊糖和D-呋喃半乳糖殘基,并且可以識別諾卡氏細菌表面的呋喃半乳糖,這表明hIntL是一種新型的能識別呋喃半乳糖的凝集素,并在識別宿主的細菌時有一定的作用[5]。最近有研究發(fā)現在哮喘患者支氣管刷片和肺泡灌洗液中Intelectin表達增加。在以粘液過度分泌和氣道高反應性為共同表型的Tg-IL-13、IL-13/Epi和OVA小鼠肺組織中Intelectin表達水平均顯著增高,進一步說明Intelectin可能是與哮喘發(fā)生相關的基因[13]。我們的前期研究也發(fā)現Intelectin1和Intelectin2的表達在小鼠的肺被OVA激發(fā)改變后是上調的,且Intelectin基因表達于小鼠過敏性哮喘模型的氣道粘液細胞。Th2細胞分泌的細胞因子,IL-13是變應性氣道疾病中重要的炎癥因子[15,16]。由于Intelectin和其他趨化因子是氣道上皮細胞產生的,我們用MLE12細胞,即小鼠的肺上皮細胞去檢測Intelectin在IL-13誘導趨化因子表達中發(fā)揮的作用。我們發(fā)現IL-13增加了MCP-1和MCP-3在MLE12細胞中的表達。IL-13也刺激了Intelectin1和2在MLE12細胞中的表達。此外我們還用了Intelectin shRNA和一種Intelectin的抑制劑-半乳糖,我們發(fā)現IL-13誘導MCP-1和MCP-3不論是在mRNA水平還是蛋白水平的表達都需要Intelectin基因。據我們所知,這是第一次研究發(fā)現,Intelectin介導IL-13誘導MCP-1和MCP-3上調,但就其具體機制尚不清楚。 為此本課題應用RNA干擾技術下調Intelectin1和2在OVA誘發(fā)的哮喘小鼠氣道中的表達水平,觀察哮喘炎癥的變化及炎癥介質MCP-1和MCP-3的變化,并用IL-13刺激MLE12細胞,進一步研究Intelectin是否介導IL- 13誘導MCP-1和MCP-3上調的信號通路以及是何種信號通路,旨在為治療哮喘提供新的思路。本試驗主要分為兩個部分: 第一部分Intelectin在哮喘小鼠氣道炎癥及炎癥介質MCP-1和MCP-3表達中的作用 目的:觀察Intelectin在哮喘小鼠氣道炎癥及炎癥介質MCP-1和MCP-3表達中的作用 方法:實驗分為三組(1)正常小鼠+陰性對照質粒組,(2)哮喘小鼠+陰性對照質粒組,(3)哮喘小鼠+Intelectin shRNA組。通過滴鼻的方法法將轉染試劑和質粒分別滴入各組小鼠鼻內。Real time PCR檢測各組Intelectin1,2及MCP-1和MCP-3 mRNA水平的表達情況。免疫組化法檢測Intelectin在肺組織中的表達。對各組小鼠肺組織氣道進行炎癥分數評分,及對各組小鼠肺泡灌洗液中的細胞進行分類計數以觀察小鼠肺組織炎癥的變化。 結果:Intelectin1,2, OVA + shRNA組較OVA組分別降低72%和59%, P 0.05; MCP-1, MCP-3, OVA + shRNA組較OVA組明顯降低, P 0.05;BALF中嗜酸性粒細胞計數, OVA + shRNA組較OVA組減少76%, P 0.05 ;OVA組炎癥分數明顯高于對照組, P 0.01,OVA + shRNA組較OVA組炎癥分數顯著降低, P 0.05,以上均有統(tǒng)計學意義。 結論:抑制Intelectin后MCP-1和MCP-3表達水平降低,哮喘小鼠的氣道炎癥減輕,嗜酸性粒細胞減少。 第二部分Intelectin在IL-13誘導的小鼠肺上 皮細胞MCP-1和MCP-3表達中的作用和機制 目的:探討Intelectin在IL-13誘導的小鼠肺上皮細胞炎癥介質MCP-1和MCP-3表達中的作用和機制 方法:用IL-13分別干預MLE12細胞并轉染Intelectin shRNA,實驗分為三組(1)對照+陰性對照質粒組, (2) IL-13 +陰性對照質粒組,(3) IL-13 + Intelectin shRNA組。用Real time PCR檢測Intelectin1和2, MCP-1和MCP-3 mRNA的表達;用Western-Blot檢測ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平的變化。用IL-13和PD98059分別干預小鼠肺上皮細胞株MLE12細胞。實驗分為三組(1)對照組,(2) IL-13組,(3) IL-13 + PD98059組,然后通過Real time PCR檢測趨化因子MCP-1,MCP-3 mRNA表達。 結果:IL-13 + shRNA組較IL-13組Intelectin1和2, MCP-1和MCP-3 mRNA的表達均降低,P 0.05;IL-13 + PD98059組MCP-1, MCP-3 mRNA的表達較IL-13組明顯降低, P 0.01;IL-13組P-ERK1/2蛋白表達較對照組升高, P 0.01, IL-13 + shRNA組P-ERK1/2蛋白表達較IL-13組降低, P 0.01。 結論:抑制Intelectin可抑制MCP-1和MCP-3的表達。PD98059, ERK1/2的一種抑制劑,可以阻滯IL-13誘導的MCP-1,MCP-3在MLE12中的表達。另外,IL-13的刺激增加了ERK1/2磷酸化,但Intelectin shRNA轉染抑制了IL-13誘導的ERK1/2磷酸化。這些數據顯示了ERK1/2通路可以調節(jié)IL-13誘導MCP-1和MCP-3的表達,IL-13誘導ERK1/2在小鼠肺上皮細胞激活需要Intelectin基因的表達。因此我們可以這樣認為,Intelectin基因至少通過促進ERK1/2的激活,可能會參與IL-13誘導MCP-1和MCP-3的表達。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R562.25

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本文編號：2824679