臨床上肺纖維化,特別是特發(fā)性肺纖維化(IPF,idiopathic pulmonary fibrosis)是一種慢性、不可逆的組織病變過程,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治愈差。當(dāng)前國(guó)際上用于治療肺纖維化的藥物只有尼達(dá)尼布(BF,Nintedanib,商品名:Ofev)和吡非尼酮(PFD,Pirfenidone,商品名:Esbriet)兩種,但兩者治療效果有限,并均存在一定的不良反應(yīng),因此,研發(fā)新的高效的肺纖維化治療藥物具有非常重要的意義。PMID(3-(3-Pyridylmethylidene)-2-Indolinone)是本實(shí)驗(yàn)室利用基于Keap1/Nrf2(NF-E2-related factor 2/Antioxidant Response Element)蛋白質(zhì)相互作用的藥物篩選技術(shù)平臺(tái),篩選得到的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的小分子抗氧化化合物,前期研究發(fā)現(xiàn)PMID可增強(qiáng)Nrf2的磷酸化及穩(wěn)定性,進(jìn)而激活Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路,上調(diào)抗氧化相關(guān)基因SOD(superoxide dismutase)、NQO1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1)的表達(dá)。其次,前期按照臨床前藥代動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)原則,實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)PMID在體內(nèi)呈現(xiàn)一定的吸收消除分布規(guī)律,代謝穩(wěn)定,生物利用度較好。此外,我們前期研究還發(fā)現(xiàn)PMID對(duì)低劑量輻射損傷以及對(duì)博來霉素(BLM,Bleomycin)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有很好的防護(hù)效果,PMID的合成以及在肺纖維化治療中的應(yīng)用已經(jīng)申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?201610794652.6)。為進(jìn)一步明確PMID對(duì)肺纖維化的防護(hù)效果,本研究我們采用兩種肺纖維化動(dòng)物模型:博來霉素(BLM)所致大鼠肺纖維化模型以及二氧化硅(SiO_2)所致小鼠肺纖維化模型,系統(tǒng)評(píng)價(jià)了PMID對(duì)肺纖維化的防護(hù)效果,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過肺部噴霧造模的方式,首先確立兩種模型的最佳噴霧劑量,接著采用預(yù)防給藥和治療給藥兩種給藥方式,實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(NC,Normal control),模型對(duì)照組(MC,Model control),PMID給藥組(低、中、高劑量)以及陽性藥組尼達(dá)尼布(BF,nintedanib)和吡非尼酮(PFD,pirfenidone),造模28天后,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行肺呼吸功能檢測(cè),處死動(dòng)物,采用HE染色觀察肺組織病理損傷程度,Masson染色、天狼星紅染色以及定量分析肺組織中膠原形成情況,采用免疫組化分析纖維化相關(guān)蛋白TGF-β(Transforming growth factor-β)、Col1A2(Collagen1A2)、α-SMA(α-smooth muscle actin)以及炎癥細(xì)胞不同標(biāo)志包括CD11b、F4/80、CD3的表達(dá)情況。Real-time PCR分析肺組織中炎癥細(xì)胞因子及肺纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。在PMID對(duì)BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的防護(hù)作用研究中,我們?cè)u(píng)價(jià)了PMID預(yù)防給藥和治療給藥對(duì)肺纖維化的防護(hù)效果。結(jié)果顯示,無論是預(yù)防給藥還是治療給藥,PMID均可有效緩解大鼠的肺臟損傷,降低膠原物質(zhì)的產(chǎn)生,以及降低纖維化相關(guān)因子表達(dá),減輕BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化程度。造模后立即給藥,PMID可有效抑制BLM誘導(dǎo)肺纖維化的炎癥階段和肺纖維化轉(zhuǎn)變;在急性損傷期給藥,PMID可有效緩解肺臟急性炎癥,減少肺纖維化過程中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的數(shù)量,并顯著降低炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α,tumor necrosis factor-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β,Interleukin-1β)和白細(xì)胞介素6(IL-6,Interleukin-6)的水平;同時(shí)PMID可有效減少膠原物質(zhì)的產(chǎn)生,降低纖維化相關(guān)因子TGF-β(Transforming growth factor-β)的表達(dá),延緩肺纖維化的疾病進(jìn)程;在纖維化轉(zhuǎn)變時(shí)期給藥,PMID可有效緩解肺纖維化大鼠的病理損傷以及降低膠原含量,減少α-SMA和Collagen1的表達(dá),提示我們PMID可以有效抑制BLM誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段,延緩疾病進(jìn)程。在PMID對(duì)二氧化硅誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的防護(hù)作用研究中,我們發(fā)現(xiàn)無論是預(yù)防給藥還是治療給藥,PMID均可有效緩解小鼠的肺臟損傷,降低膠原物質(zhì)的產(chǎn)生以及下調(diào)相關(guān)免疫分子的表達(dá),并且存在一定的劑量效應(yīng),給藥組明顯優(yōu)于陽性藥組,顯示PMID對(duì)肺纖維化良好的防護(hù)效果。在細(xì)胞水平以及分子水平對(duì)其炎性細(xì)胞的種類及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)給藥組巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著降低,組織中IL-6的表達(dá)也顯著降低。提示PMID可以通過抑制肺纖維化過程的炎癥階段,抑制肺纖維化的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

圖 1-1 大鼠博來霉素(BLM)肺纖維化模型的確立(n=5)Fig1-1. The establishment of a model of pulmonary fibrosis with bleomycin (BLM) in ratsA.噴霧模型圖示；B.肺呼吸頻率測(cè)定；C.生存率測(cè)定；D.H&E 染色與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0013.2 PMID 預(yù)防給藥可有效緩解 BLM 所致大鼠的肺纖維化

圖 1-2 造模 7 天后肺組織外觀及組織病理變化(n=3, ×100)Fig1-2.Changes of lung tissue appearance and histopathology after 7 days of modelingA. 肺組織外觀；B.造模 7 天后 H&E 染色；C. H&E 染色評(píng)分與模型組比較，*P<0.05，**P<0.013.2.2 PMID 預(yù)處理緩解大鼠的肺臟纖維化程度（預(yù)防給藥，造模 28 天后處死大鼠）

圖 1-3 造模 28 天后肺組織外觀及組織病理變化(n=7, ×100)Fig1-3.Changes of lung tissue appearance and histopathology after 28 days of modelingA. 肺組織外觀；B.造模 28 天后 H&E 染色；C. H&E 染色評(píng)分與模型組比較，*P<0.05，**P<0.013.2.3 PMID 預(yù)處理可顯著降低肺纖維化大鼠中的膠原含量（預(yù)防給藥，造模 28 天后

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