在基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,已經(jīng)有許多令人矚目的研究成果。隨著脂質(zhì)組學(xué)概念的提出,人們?nèi)找姘l(fā)現(xiàn)脂質(zhì)的功能并不僅僅只局限于以前所認識到的,它們在生物領(lǐng)域發(fā)揮的作用可能超出了人們的想象。脂筏就是一種位于細胞膜上由脂質(zhì)構(gòu)成的功能單位體。它由豐富的鞘脂、膽固醇及特定的蛋白質(zhì)動態(tài)聚集而成,形成相對穩(wěn)定的具有一定功能的筏結(jié)構(gòu)漂浮于流動的細胞膜中。當細胞受到某種刺激時,脂筏被酸性鞘磷脂酶(ASM)激活并釋放出大量由鞘磷脂水解而來的神經(jīng)酰胺,后者迅速相互聯(lián)接形成微區(qū),這些微區(qū)又可以迅速聯(lián)結(jié)形成一個或幾個平臺區(qū)。神經(jīng)酰胺富含膜區(qū)為蛋白質(zhì)等生物活性分子之間的相互作用提供了平臺。脂筏廣泛參與了細胞的各種生物學(xué)行為,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的作用尤為重要。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,與多種炎癥細胞及炎癥介質(zhì)相關(guān),氣道上皮細胞是氣道炎癥的主要效應(yīng)細胞。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是哮喘炎癥過程中重要的啟動因子,它可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)一系列炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,導(dǎo)致氣道上皮細胞損傷以及氣道粘液過度分泌。NF-κB廣泛存在于各種組織細胞,能與多種基因啟動子上κB序列結(jié)合并促進轉(zhuǎn)錄,通過調(diào)控許多重要的細胞因子,粘附分子,趨化因子的基因表達而參與機體的各種免疫炎癥反應(yīng)。DUOX-1是糖蛋白p91Phox的同系物,可以表達于氣道上皮細胞,能夠催化其底物產(chǎn)生過氧化氫,引起細胞損傷并刺激細胞分泌大量粘液。 本研究擬探討脂筏-神經(jīng)酰胺通路在TNF-α引起的NF-κB激活以及其下游靶基因的表達中是否發(fā)揮作用,以期為哮喘等氣道炎癥性疾病的防治提供新的策略。 目的 人氣道上皮細胞膜脂筏-神經(jīng)酰胺被破壞后,TNF-α刺激細胞引起的NF-κB激活及DUOX1表達所受到的影響。DUOX1的表達是否依賴NF-κB的激活。 方法 1.基于ELISA的轉(zhuǎn)錄因子活性測定方法檢測細胞內(nèi)NF-κB活性。用5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml TNF-α分別處理人氣道上皮細胞15min,30min,60min。選取能最大程度激活NF-κB的TNF-α濃度和刺激時間進行細胞分組實驗并檢測細胞內(nèi)NF-κB活性。①對照組②TNF-α刺激組: 10ng/mlTNF-α處理細胞15min。③膽固醇剔除劑甲基-β-環(huán)糊精(M-β-CD)M-β-CD組:10mM M-β-CD處理細胞30min。④MT組: M-β-CD處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑤膽固醇結(jié)合劑菲律賓菌素Ⅲ(FilipinⅢ),Filipin組:用6ug/ml Filipin處理細胞1小時。⑥FT組:用Filipin處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑦酸性鞘磷脂酶抑制劑地昔帕明(Desipramine),Desipramine組:10μM Desipramine處理細胞1小時。⑧DT組:用Desipramine處理細胞后再用細胞因子刺激細胞。 2. Western blot檢測細胞DUOX-1的表達。細胞分組為:①對照組②TNF-α刺激組: 10ng/ml TNF-α處理細胞3小時。③M-β-CD組:10mM M-β-CD處理細胞30min。④MT組:MβCD處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑤Desipramine組:10μM Desipramine處理細胞1小時。⑥D(zhuǎn)T組:Desipramine處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。 3.免疫組化觀察細胞漿中DUOX-1的表達。細胞分組為:①對照組②TNF-α刺激組:10ng/ml TNF-α處理細胞3小時。③MT組:10mM M-β-CD處理細胞30min后再用TNF-α刺激細胞。④DT:10μM Desipramine處理細胞1小時細胞后再用TNF-α刺激細胞。 4. DNA decoy。細胞分組為:①對照組。②TNF-α刺激組:10ng/ml TNF-α處理細胞3小時。③轉(zhuǎn)染試劑組:轉(zhuǎn)染試劑處理細胞過夜。④DNA轉(zhuǎn)染組:用轉(zhuǎn)染試劑將DNA雙鏈轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)后,再用10ng/ml TNF-α處理細胞。 5.統(tǒng)計分析:單因素方差分析。 結(jié)果 1.10ng/ml TNF-α處理氣道上皮細胞15min激活細胞內(nèi)NF-κB最明顯(P0.05)。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的NF-κB活性增加(P0.05)。 2. TNF-α刺激細胞引起DUOX-1表達增加(P0.05)。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1表達增加(P0.05)。 3. TNF-α刺激細胞后,在電鏡下其胞漿中DUOX-1顆粒明顯增加。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1顆粒增加。 4.NF-κB的DNA結(jié)合序列轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)后可以抑制TNF-α刺激引起的細胞DUOX-1表達增加(P0.05)。 結(jié)論 1.TNF-α可以明顯激活氣道上皮細胞內(nèi)NF-κB;脂筏-神經(jīng)酰胺信號通路參與了TNF-α所攜帶的信號向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2.TNF-α可以引起氣道上皮細胞DUOX-1表達增加; DUOX-1的表達依賴NF-κB的激活,這一過程也依賴于脂筏-神經(jīng)酰胺信號通路。 3.脂筏干擾劑M-β-CD、FilipinⅢ以及Desipramine有望用于支氣管哮喘等氣道炎癥性疾病的治療。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R562.25

【參考文獻】

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本文編號：2822405