研究背景 哮喘是由細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)的以嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)浸潤(rùn)為主的氣道慢性炎癥性疾病�；罨腅OS可釋放主要堿性蛋白(MBP)等多種炎性介質(zhì),引起局部炎癥反應(yīng),激發(fā)氣道高反應(yīng)性,但以MBP為主的陽離子蛋白引起氣道炎癥的機(jī)制尚不清楚。資料表明氣道上皮細(xì)胞中MBP可競(jìng)爭(zhēng)抑制精氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),支氣管哮喘患者血中精氨酸水平以及它的生物利用度均低于非哮喘患者。研究表明細(xì)胞因子可調(diào)控炎癥反應(yīng),在哮喘氣道炎癥產(chǎn)生和持續(xù)過程中發(fā)揮重要作用。但在氣道上皮細(xì)胞中精氨酸對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控及其具體機(jī)制尚不清楚。 目的 研究精氨酸和陽離子蛋白在前炎癥因子誘導(dǎo)下,促炎癥介質(zhì)在肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其機(jī)制,以闡明精氨酸和陽離子蛋白在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中所起的作用。 方法 1.哮喘氣道炎癥微環(huán)境細(xì)胞模型的建立 為模仿哮喘氣道炎癥微環(huán)境,用前炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)和脂多糖(LPS)預(yù)先將氣道上皮細(xì)胞激活,制成哮喘氣道上皮細(xì)胞模型。并且在加入刺激物之前,用不含血清的RPMI 1640再洗1次,以去除內(nèi)源性細(xì)胞因子和排除血清的影響,不加任何刺激物的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 2.IL-6和IL-8水平及IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的測(cè)定 收集上述細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)夾心法測(cè)定其中IL-6和IL-8水平。mRNA測(cè)定運(yùn)用TriZol提取NCI-H292細(xì)胞總RNA,后用斑點(diǎn)印跡法,特殊~(32)P標(biāo)記探針的雜交法檢測(cè)IL-6,IL-8和GAPDH mRNA的水平,斑點(diǎn)以磷光計(jì)量化,并以看家基因GAPDH的mRNA表達(dá)水平校正。 3.陽離子蛋白抑制左旋精氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能力的測(cè)定 NCI-H292細(xì)胞或NHBE細(xì)胞過夜培養(yǎng),Hank's平衡溶解液(HBSS)清洗后,然后在含有不同濃度的多聚左旋精氨酸或MBP的HBSS中培養(yǎng)24小時(shí)后,加入~(14)C標(biāo)記的左旋精氨酸,最后溶解細(xì)胞,采用放射免疫分析法(RIA)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)~(14)C標(biāo)記的左旋精氨酸,以不含陽離子蛋白作為對(duì)照。 4.IL-6 mRNA和IL-8 mRNA降解的測(cè)定 NCI-H292細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),按照實(shí)驗(yàn)要求加入刺激物和反應(yīng)物,細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)后,以放線菌素C1終止轉(zhuǎn)錄,在0,40,80分鐘時(shí)測(cè)定剩余IL-6,IL-8和GAPDH mRNA的水平,同樣以看家基因GAPDH的mRNA表達(dá)水平校正。 5.磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染NCI-H292細(xì)胞 首先構(gòu)建含有IL-6和IL-8基因啟動(dòng)子區(qū)域的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因的載體,當(dāng)NCI-H292細(xì)胞生長(zhǎng)到70%時(shí),將上述載體轉(zhuǎn)染到NCI-H292細(xì)胞,培養(yǎng)24小時(shí)后按照實(shí)驗(yàn)要求加入各種刺激物,18小時(shí)收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞,裂解細(xì)胞,用CAT ELISA試劑盒檢測(cè)各組CAT蛋白的含量。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有參數(shù)及其比較均采用SPSS11.5軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析;多樣本比較先采用單因素方差分析,兩兩比較當(dāng)方差齊時(shí)采用LSD方法,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3方法;相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析,差異比較P≤0.05考慮有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.低水平左旋精氨酸調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞IL-6和IL-8的表達(dá) 1.1不同培養(yǎng)液對(duì)NCI-H292細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響:因?yàn)镹CI-H292細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基中(RPMI-1640)含有1mM左旋精氨酸,為了解不同培養(yǎng)基對(duì)IL-6和IL-8表達(dá)的影響,比較NCI-H292細(xì)胞在不含精氨酸的最低需要培養(yǎng)基(MEM-A~-)與含1mM左旋精氨酸的MEM(MEM-A~+)和RPMI-1640三種不同培養(yǎng)液中,LPS或TNF-α共刺激后的IL-6和IL-8的表達(dá),H292細(xì)胞在RPMI-1640和MEM-A+中產(chǎn)生的IL-6或IL-8水平均無明顯差異(所有P＞0.05,IL-6和IL-8),說明左旋精氨酸相同濃度下,RPMI-1640和MEM兩種不同培養(yǎng)基的其他成分對(duì)NCI-H292細(xì)胞的IL-6和IL-8的表達(dá)無顯著的影響。另外,在MEM-A~-中較MEM-A~+產(chǎn)生更多的IL-6或IL-8,且與TNF-α的濃度成正相關(guān)(r=0.604,P=0.001;r=0.730,P＜0.001,IL-6和IL-8),但與LPS無明顯相關(guān)(r=0.017,P=0.929;r=0.218,P=0.246,IL-6和IL-8)。 1.2不同劑量左旋精氨酸對(duì)NCI-H292細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響:左旋精氨酸在0到1mM之間,隨著左旋精氨酸濃度的上升,IL-6的水平反而下降,兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.513;P=0.03),低水平左旋精氨酸也升高NCI-H292細(xì)胞IL-8的水平,然而我們沒有發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸和IL-8呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 1.3低水平的左旋精氨酸可使支氣管原代上皮細(xì)胞(NHBE)的IL-8表達(dá)增高:與MEM-A~+相比較,在MEM-A~-培養(yǎng)基中不加刺激物和LPS組,NHBE細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8顯著高于相應(yīng)的MEM-A~+培養(yǎng)基組(P=0.001和P=0.003),但對(duì)于TNF-α刺激的NHBE細(xì)胞的IL-8在兩者之間無明顯差異(P=0.11)。 2.陽離子蛋白與左旋精氨酸的關(guān)系,以及在前炎癥因子誘導(dǎo)下促炎癥介質(zhì)的表達(dá) 2.1多聚左旋精氨酸在NCI-H292細(xì)胞中的作用:多聚左旋精氨酸(≥10μg/ml)顯著抑制左旋精氨酸進(jìn)入NCI-H292細(xì)胞內(nèi)(P＜0.001),多聚左旋精氨酸與LPS聯(lián)合作用顯著升高IL-6和IL-8,特別是當(dāng)多聚左旋精氨酸為5μg/ml時(shí)最顯著。IL-6與多聚左旋精氨酸抑制左旋精氨酸的再攝取呈負(fù)相關(guān),這種作用并不受LPS的影響(r=-0.662,P=0.001:r=-0.598,P＜0.01)。IL-8的表達(dá)略不同于IL-6,這種相關(guān)性與多聚左旋精氨酸的濃度密切聯(lián)系,當(dāng)多聚左旋精氨酸為0至5μg/ml時(shí),兩者同IL-6呈負(fù)相關(guān)(r=-0.895,P＜0.001);而當(dāng)濃度為5至80μg/ml時(shí),則呈正相關(guān)(r=0.896,P＜0.001)。 此外,H292細(xì)胞在多聚左旋精氨酸和LPS共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)IL-6和IL-8的水平與LPS的劑量呈效應(yīng)關(guān)系,然而,多聚左旋精氨酸與TNF-α之間未見協(xié)同作用。 2.2 MBP在NCI-H292細(xì)胞中的作用:一定濃度的MBP同樣抑制左旋精氨酸的再攝取,并且與MBP的濃度呈依賴性(r=-0.737,P＜0.001)。MBP與多聚左旋精氨酸作用類似,MBP與LPS共同作用顯著升高IL-6和IL-8;不同的是,只有LPS不存在于培養(yǎng)基中,IL-6和IL-8的水平與MBP抑制左旋精氨酸的再攝取呈負(fù)相關(guān)(r=-0.752,P＜0.001:r=-0.784,P＜0.001),而當(dāng)LPS存在于培養(yǎng)基中時(shí),MBP抑制左旋精氨酸的再攝取能力與IL-6和IL-8的水平無相關(guān)性(r=0.083,P=0.744;r=-0.080,P=0.752)。 2.3多聚左旋精氨酸在NHBE細(xì)胞中的作用:一定濃度的多聚左旋精氨酸(≥10μg/ml)同樣阻止左旋精氨酸進(jìn)入NHBE細(xì)胞內(nèi)(P＜0.001),TNF-α(t=7.264,P＜0.0001;t=6.002,P＜0.0001),而不是LPS明顯協(xié)同多聚左旋精氨酸釋放IL-6和IL-8(t=-1.693,P=0.098;t=-0.738,P=0.464)。 3.多聚左旋精氨酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-8 mRNA的水平的影響 與單一LPS相比較,NCI-H292細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基中加入多聚左旋精氨酸和LPS后,可顯著增高NCI-H292細(xì)胞在培養(yǎng)0h、1h、2h、4h、6h和24h的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的水平(所有P＜0.05,IL-6和IL-8),特別是在共培養(yǎng)2h時(shí)有一顯著高峰(P＜0.0001,P＜0.0001:IL-6和IL-8)。 4.多聚左旋精氨酸對(duì)IL-6和IL-8啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染的NCI-H292細(xì)胞的CAT水平的影響 多聚左旋精氨酸與LPS共培養(yǎng)組的IL-6-CAT和IL-8-CAT均顯著高于LPS和多聚左旋精氨酸組(P＜0.0001,P＜0.0001;P＜0.05,P＜0.05,IL-6和IL-8)。 5.多聚左旋精氨酸作用下的LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-8 mRNA的降解 NCI-H292細(xì)胞在多聚左旋精氨酸和LPS共同誘導(dǎo)下的IL-6 mRNA和IL-8mRNA的降解與單一LPS無明顯差異(P＞0.05,P＞0.05;IL-6和IL-8)。 結(jié)論 1.一定濃度的左旋精氨酸抑制NCI-H292細(xì)胞和支氣管原代上皮細(xì)胞促炎癥介質(zhì)的釋放: 2.多聚左旋精氨酸不但抑制左旋精氨酸進(jìn)入NCI-H292細(xì)胞和支氣管原代上皮細(xì)胞內(nèi),而且可在LPS刺激后升高IL-6和IL-8的表達(dá),兩者之間密切相關(guān),MBP與多聚左旋精氨酸作用類似; 3.多聚左旋精氨酸促進(jìn)LPS誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞IL-6和IL-8生成增多的機(jī)制可能在于轉(zhuǎn)錄活性增加,并非由于IL-6 mRNA和IL-8 mRNA降解減少。 研究背景 肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見疾病。約70%的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中、晚期,如能早期發(fā)現(xiàn)可以使患者的5年生存率明顯提高。由于肺癌早期或癌前病變時(shí)已發(fā)生多種基因異常,這些異常改變往往先于臨床癥狀的出現(xiàn),并在一定程度上成為早期肺癌的分子標(biāo)志物。維甲酸/干擾素誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因19(Grim-19)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因,參與調(diào)節(jié)干擾素和維甲酸誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡,但在肺癌中的表達(dá)及其在肺癌早期診斷中的價(jià)值尚不明確。 目的 研究GRIM-19蛋白在炎癥肺組織及支氣管肺癌組織中的表達(dá)和定位,以及與臨床病理資料的相關(guān)性,以探討其在肺癌早期診斷中的價(jià)值和臨床意義。 方法 1.免疫組化抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC)檢測(cè)肺癌和炎癥肺組織GRIM-19的表達(dá) 選用經(jīng)纖維支氣管鏡或CT引導(dǎo)下肺穿刺術(shù)取得的32例肺癌組織和10例炎癥肺組織,采用免疫組化抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC)檢測(cè)GRIM-19蛋白的表達(dá)。 2.分析肺癌和炎癥肺組織GRIM-19的表達(dá) 應(yīng)用JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析上述32例肺癌組織和10例炎癥肺組織免疫組化切片,并用光密度(A)值半定量描述其表達(dá)水平,進(jìn)一步比較GRIM-19蛋白在肺癌組和炎癥肺組織之間的區(qū)別。 3.分析肺癌組織中GRIM-19水平的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 將肺癌組標(biāo)本GRIM-19蛋白的表達(dá)按性別、年齡、吸煙指數(shù)、原發(fā)灶分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床病理分期等參數(shù)進(jìn)行分組,分析GRIM-19蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。 4.采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)GRIM-19在肺組織細(xì)胞內(nèi)的定位 采用激光共聚焦技術(shù)對(duì)GRIM-19蛋白在各種正常肺組織結(jié)構(gòu)、炎癥肺組織及肺癌組織中的定位進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析;多樣本比較先采用單因素方差分析,兩兩比較當(dāng)方差齊時(shí)采用LSD方法,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3方法;相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析,P≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.GRIM-19在各種細(xì)胞類型的肺癌和炎癥肺組織中的表達(dá) GRIM-19蛋白表達(dá)在肺鱗癌組、腺癌組、小細(xì)胞肺癌組和炎癥組之間存在顯著性差異(P＜0.001),鱗癌組、腺癌組和小細(xì)胞肺癌組的GRIM-19蛋白的表達(dá)均低于炎癥組(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.001),小細(xì)胞肺癌組的GRIM-19蛋白低于非小細(xì)胞肺鱗癌和腺癌組(P＜0.01,P＜0.01),但在鱗癌組和腺癌組之間無顯著性差異(P＞0.05)。 2.肺癌組織中GRIM-19的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 GRIM-19蛋白在非小細(xì)胞肺癌Ⅰ-Ⅱ期中的表達(dá)量顯著高于Ⅲ-Ⅳ期患者(P＜0.01),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19與非小細(xì)胞肺癌的原發(fā)灶分期(T)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),而與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)無顯著相關(guān)性(P＞0.05,P＞0.05),與肺癌患者的性別、年齡及吸煙指數(shù)均無顯著相關(guān)性(P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05)。 3.GRIM-19在各種肺組織中的分布GRIM-19蛋白在正常及炎癥肺組織中主要分布于細(xì)胞漿;而在肺癌組織中,GRIM-19蛋白除了部分表達(dá)在細(xì)胞漿之外,主要集中于細(xì)胞核。 結(jié)論 1.GRIM-19在正常肺組織高表達(dá),在炎癥肺組織中的表達(dá)高于肺癌組織的表達(dá),且與肺癌的組織學(xué)分型有一定的關(guān)系; 2.GRIM-19在非小細(xì)胞肺癌Ⅰ-Ⅱ期中的表達(dá)量顯著高于Ⅲ-Ⅳ期患者,并與肺癌的原發(fā)灶分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,而與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者的性別、年齡及吸煙指數(shù)均無顯著相關(guān)性; 3.GRIM-19表達(dá)降低在肺癌的發(fā)展起著重要的作用,在細(xì)胞癌變的過程中GRIM-19由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,GRIM-19在細(xì)胞核的表達(dá)是肺組織癌變的一個(gè)早期和重要的現(xiàn)象,可能會(huì)成為肺癌早期診斷的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2822705