急慢性支氣管炎引起氣道粘膜上皮細(xì)胞損傷,在其后的修復(fù)過程中,周圍上皮細(xì)胞遷移、分裂增生和分化,以重新覆蓋受損區(qū)域。細(xì)胞遷移時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變、胞膜突起的定向及中心體的極化,分裂時(shí)染色體的捕獲及紡錘體的形成和定向,這些細(xì)胞活動(dòng)過程均有賴于微管、微絲、Rho GTP酶及微管相關(guān)蛋白之間復(fù)雜的相互作用。Rho GTP酶是Ras超家族中小分子量G蛋白的成員之一,是一組分子量約為20～25kd的鳥苷酸結(jié)合蛋白,在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān),作用于細(xì)胞骨架或其靶蛋白而產(chǎn)生多種生物效應(yīng),包括Cdc42、RhoA、Rac等,其中以Cdc42研究最多。微管相關(guān)蛋白包括APC(adenomatous polyposis coli)、EB1(end-binding protein)、CLIP-170(cytoplasmic linker protein-170)和CLASP(CLIP-associated protein)等,它們結(jié)合在微管正極上,參與微管動(dòng)力學(xué)和功能的調(diào)節(jié)。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)在細(xì)胞內(nèi)呈組成性激活,APC和CLASP都是其底物。GSK3β活性改變及其對(duì)一些微管相關(guān)蛋白的磷酸化修飾,能夠影響微管的動(dòng)力學(xué)和功能,進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移、分裂等生命活動(dòng)。 目的 研究GSK3β及CLIP-170在博萊霉素引起的小鼠氣道上皮損傷和修復(fù)中的表達(dá)變化及其意義,以進(jìn)一步闡明上皮損傷后修復(fù)的分子機(jī)制。 方法 健康昆明種小鼠(雌雄不拘)36只,腹腔注射麻醉后經(jīng)氣管插管一次性緩慢注入BLMA5 5mg/kg,誘導(dǎo)其氣道上皮急性損傷。隨后分批處死小鼠,獲取肺組織和氣管,以6只正常小鼠作為對(duì)照。用免疫組織化學(xué)S-P法檢測GSK3β及CLIP-170蛋白在氣道上皮細(xì)胞中的定位與表達(dá);用western blot技術(shù)檢測GSK3β、P-GSK3β、Cdc42及CLIP-170在損傷修復(fù)過程中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化;并用免疫雙標(biāo)和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測GSK3β及CLIP-170分別與微管蛋白β-tubulin的共定位關(guān)系。 結(jié)果 一、大體觀察: 正常組小鼠雙肺紅潤,表面光滑,彈性良好。實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織出現(xiàn)點(diǎn)狀出血、腫脹,后期肺組織體積縮小、硬度增加等不同程度的病理變化。 二、HE鏡下觀察: 光鏡下正常氣道上皮細(xì)胞排列整齊,為假復(fù)層纖毛柱狀上皮或纖毛柱狀上皮。實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤,氣道及肺泡上皮細(xì)胞壞死、脫落,纖毛倒伏,繼而炎性細(xì)胞減少,上皮細(xì)胞修復(fù),肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生,纖維化。 三、免疫組化染色: GSK3β在正常對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)水平較高,BLM刺激后4d及7d時(shí)GSK3β表達(dá)迅速降低(P0.01),而在隨后的14d及28d時(shí)又有所回升(P0.01),但仍低于對(duì)照組;CLIP-170在正常對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈低表達(dá),實(shí)驗(yàn)組則隨著損傷的進(jìn)行而表達(dá)逐漸升高,兩組間差別具有顯著性意義(P0.01)。四、western blot檢測: GSK3β在實(shí)驗(yàn)組早期損傷階段水平降低,修復(fù)末期回升(P0.01); P-GSK3β呈相反變化。Cdc42在實(shí)驗(yàn)組早期損傷階段升高,隨后漸呈下降趨勢(P0.05);CLIP-170在實(shí)驗(yàn)組給予BLM后呈持續(xù)升高趨勢,與對(duì)照組比較,P0.01。 五、免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測: β-tubulin在正常對(duì)照組小鼠氣道上皮中分布較彌散,BLM刺激后4d、7dβ-tubulin明顯沿氣道上皮細(xì)胞近腔面和側(cè)緣細(xì)胞膜下呈線狀分布,肺泡上皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)表達(dá)。CLIP-170及GSK3β的分布與β-tubulin比較一致,BLM14d、28d時(shí),CLIP-170、GSK3β和β-tubulin均出現(xiàn)向胞質(zhì)內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移、彌散分布的趨勢。 結(jié)論 1. GSK3β的磷酸化與Cdc42調(diào)節(jié)有關(guān); 2. GSK3β和P-GSK3β在氣道上皮損傷與修復(fù)過程中呈波動(dòng)性變化并在形態(tài)學(xué)上與微管共定位,提示其可能參與調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白在微管正極末端的聚集與結(jié)合; 3. CLIP-170在氣道上皮損傷后表達(dá)增強(qiáng)且可能與微管蛋白結(jié)合,促使微管向細(xì)胞周邊聚集。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R562.21
【部分圖文】：

Westernblot蛋白印跡法檢測小鼠肺組

Westernblot蛋白印跡檢測CLIP-170

圖23圖23BLM7d組CLIP-170激發(fā)紅色熒光，向氣道上皮細(xì)胞近腔面和側(cè)緣聚集（CLSM×

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820659