急慢性支氣管炎引起氣道粘膜上皮細胞損傷,在其后的修復過程中,周圍上皮細胞遷移、分裂增生和分化,以重新覆蓋受損區(qū)域。細胞遷移時細胞形態(tài)改變、胞膜突起的定向及中心體的極化,分裂時染色體的捕獲及紡錘體的形成和定向,這些細胞活動過程均有賴于微管、微絲、Rho GTP酶及微管相關蛋白之間復雜的相互作用。Rho GTP酶是Ras超家族中小分子量G蛋白的成員之一,是一組分子量約為20～25kd的鳥苷酸結合蛋白,在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器或分子開關,作用于細胞骨架或其靶蛋白而產(chǎn)生多種生物效應,包括Cdc42、RhoA、Rac等,其中以Cdc42研究最多。微管相關蛋白包括APC(adenomatous polyposis coli)、EB1(end-binding protein)、CLIP-170(cytoplasmic linker protein-170)和CLASP(CLIP-associated protein)等,它們結合在微管正極上,參與微管動力學和功能的調節(jié)。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)在細胞內呈組成性激活,APC和CLASP都是其底物。GSK3β活性改變及其對一些微管相關蛋白的磷酸化修飾,能夠影響微管的動力學和功能,進而影響細胞的遷移、分裂等生命活動。 目的 研究GSK3β及CLIP-170在博萊霉素引起的小鼠氣道上皮損傷和修復中的表達變化及其意義,以進一步闡明上皮損傷后修復的分子機制。 方法 健康昆明種小鼠(雌雄不拘)36只,腹腔注射麻醉后經(jīng)氣管插管一次性緩慢注入BLMA5 5mg/kg,誘導其氣道上皮急性損傷。隨后分批處死小鼠,獲取肺組織和氣管,以6只正常小鼠作為對照。用免疫組織化學S-P法檢測GSK3β及CLIP-170蛋白在氣道上皮細胞中的定位與表達;用western blot技術檢測GSK3β、P-GSK3β、Cdc42及CLIP-170在損傷修復過程中表達的動態(tài)變化;并用免疫雙標和共聚焦顯微鏡技術檢測GSK3β及CLIP-170分別與微管蛋白β-tubulin的共定位關系。 結果 一、大體觀察: 正常組小鼠雙肺紅潤,表面光滑,彈性良好。實驗組小鼠肺組織出現(xiàn)點狀出血、腫脹,后期肺組織體積縮小、硬度增加等不同程度的病理變化。 二、HE鏡下觀察: 光鏡下正常氣道上皮細胞排列整齊,為假復層纖毛柱狀上皮或纖毛柱狀上皮。實驗組小鼠肺組織炎性細胞浸潤,氣道及肺泡上皮細胞壞死、脫落,纖毛倒伏,繼而炎性細胞減少,上皮細胞修復,肺間質成纖維細胞增生,纖維化。 三、免疫組化染色: GSK3β在正常對照組氣道上皮細胞質內表達水平較高,BLM刺激后4d及7d時GSK3β表達迅速降低(P0.01),而在隨后的14d及28d時又有所回升(P0.01),但仍低于對照組;CLIP-170在正常對照組細胞質內呈低表達,實驗組則隨著損傷的進行而表達逐漸升高,兩組間差別具有顯著性意義(P0.01)。四、western blot檢測: GSK3β在實驗組早期損傷階段水平降低,修復末期回升(P0.01); P-GSK3β呈相反變化。Cdc42在實驗組早期損傷階段升高,隨后漸呈下降趨勢(P0.05);CLIP-170在實驗組給予BLM后呈持續(xù)升高趨勢,與對照組比較,P0.01。 五、免疫熒光及共聚焦顯微鏡檢測: β-tubulin在正常對照組小鼠氣道上皮中分布較彌散,BLM刺激后4d、7dβ-tubulin明顯沿氣道上皮細胞近腔面和側緣細胞膜下呈線狀分布,肺泡上皮細胞質內也出現(xiàn)表達。CLIP-170及GSK3β的分布與β-tubulin比較一致,BLM14d、28d時,CLIP-170、GSK3β和β-tubulin均出現(xiàn)向胞質內側轉移、彌散分布的趨勢。 結論 1. GSK3β的磷酸化與Cdc42調節(jié)有關; 2. GSK3β和P-GSK3β在氣道上皮損傷與修復過程中呈波動性變化并在形態(tài)學上與微管共定位,提示其可能參與調節(jié)微管相關蛋白在微管正極末端的聚集與結合; 3. CLIP-170在氣道上皮損傷后表達增強且可能與微管蛋白結合,促使微管向細胞周邊聚集。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R562.21
【部分圖文】：

Westernblot蛋白印跡法檢測小鼠肺組

Westernblot蛋白印跡檢測CLIP-170

圖23圖23BLM7d組CLIP-170激發(fā)紅色熒光，向氣道上皮細胞近腔面和側緣聚集（CLSM×

【參考文獻】

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本文編號：2820659