慢性低氧性肺動脈高壓(CHPH)是大部分慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者最終發(fā)展成為肺心病而死亡的主要原因,關于其發(fā)病機制已經(jīng)進行了大量的研究,臨床以此為基礎的治療也取得了一定的療效,然而,臨床治療CHPH的手段仍然有限,療效依然欠佳。肺血管低氧早期(急性低氧)的收縮反應和慢性低氧性肺血管結構重建是CHPH發(fā)生的主要機制,造成CHPH的這兩個主要環(huán)節(jié)不僅發(fā)生在肺動脈,而且包括肺靜脈。盡管關于肺動脈急性低氧性收縮反應和慢性低氧性肺血管結構重建的機制已經(jīng)進行了大量的研究,然而,關于肺靜脈的此類研究卻少有報道。大量的研究證明:細胞內(nèi)Ca~(2+)在血管平滑肌細胞的收縮和增生的復雜機制中起至關重要的作用。但是,關于肺靜脈平滑肌細胞(PVSMC)Ca~(2+)信號轉(zhuǎn)導以及低氧對PVSMC細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度([Ca~(2+)]_i)作用的研究卻鮮有報道,我們推測:低氧可能通過某些機制使PVSMC的[Ca~(2+)]_i改變,參與CHPH的發(fā)生、發(fā)展過程。因此,我們建立了大鼠遠端PVSMC原代培養(yǎng)模型及CHPH大鼠模型,對急慢性低氧誘導大鼠遠端肺靜脈平滑肌[Ca~(2+)]_i改變的作用及機理進行了研究。從以往研究甚少的肺靜脈方面來闡述CHPH發(fā)生的可能機制,為尋找有效的防治肺動脈高壓的方法打下堅實的理論基礎。 方法 一、急性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影響:首先利用膠原酶消化法分離、原代培養(yǎng)大鼠遠端PVSMC,通過細胞形態(tài)學觀察、平滑肌細胞α-actin免疫熒光和western-blot免疫印跡分析以及[Ca~(2+)]_i對高鉀KRBS溶液的反應來鑒定PVSMC,從而建立大鼠遠端PVSMC原代培養(yǎng)模型。然后利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),觀測急性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影響 二、急性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i影響的機制:1、利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),觀測電壓依賴性鈣通道(VDCC)拮抗劑硝苯地平對急性低氧誘導大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i改變的干預作用,明確是否有VDCC以外的鈣通道參與急性低氧誘導的大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i改變過程。2、分離大鼠遠端肺靜脈平滑肌,原代培養(yǎng)大鼠遠端PVSMC,通過熒光定量PCR和western-blot免疫印跡分析來檢測經(jīng)典瞬時受體電位(TRPC)蛋白在大鼠遠端肺靜脈平滑肌和培養(yǎng)的大鼠遠端PVSMC的mRNA水平和蛋白水平的表達,明確大鼠遠端肺靜脈平滑肌是否表達TRPC蛋白。3、利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),通過恢復細胞外鈣法、錳熒光q 滅法,并利用儲量操縱性鈣通道(SOCC)拮抗劑SKF-96365和NiCl2,在大鼠遠端PVSMC上檢測Ca~(2+)通過由TRPC蛋白組成的SOCC而形成的儲量操作性鈣內(nèi)流(SOCE),明確大鼠遠端肺靜脈平滑肌是否存在SOCE。4、利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),通過恢復細胞外鈣法、錳熒光q 滅法,并利用SOCC拮抗劑SKF-96365和NiCl2觀測急性低氧對大鼠遠端PVSMC的SOCE的影響,明確SOCE在急性低氧引起的大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i改變中的作用。 三、慢性低氧對大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影響:首先,通過慢性持續(xù)低氧(10%O2)條件下飼養(yǎng)大鼠3周建立CHPH大鼠模型;然后,分離正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC;最后,利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),分別檢測正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i,從而明確慢性低氧對大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影響。 四、慢性低氧對大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影響的機制:1、分離正常大鼠和CHPH大鼠遠端肺靜脈平滑肌,通過熒光定量PCR和Western-blot免疫印跡分析來檢測TRPC在正常大鼠和CHPH大鼠遠端肺靜脈平滑肌的表達,明確慢性低氧對大鼠遠端肺靜脈平滑肌TRPC表達的影響。2、分離正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC,利用InCyte細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng),首先分別檢測由環(huán)匹阿尼酸(CPA)誘導的正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i變化,然后分別檢測由CPA誘導的正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC的錳熒光q 滅,從而明確慢性低氧對大鼠遠端肺靜脈平滑肌SOCE的影響;接著分別檢測由油�；阴８视�(OAG)誘導的正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i變化,最后分別檢測由OAG誘導的正常大鼠和CHPH大鼠遠端PVSMC的錳熒光q 滅,從而明確慢性低氧對大鼠遠端肺靜脈平滑肌由受體操縱性鈣通道(ROCC)介導的Ca~(2+)內(nèi)流的影響。 結果 一、急性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i的影響: 1、成功建立了大鼠遠端PVSMC原代培養(yǎng)模型,原代培養(yǎng)的大鼠遠端PVSMC不僅表現(xiàn)出典型的血管平滑肌細胞的形態(tài)學和免疫學特征,而且具有完好的生理學功能。 2、急性低氧使大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高。 二、急性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i影響的機制: 1、作為VDCC拮抗劑,硝苯地平能完全阻斷高鉀KRBS溶液引起的大鼠遠端PVSMC [Ca~(2+)]_i升高,卻只能部分抑制急性低氧引起的大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高,提示VDCC以外的鈣通道參與急性低氧引起的大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高。 2、在大鼠遠端肺靜脈平滑肌組織和培養(yǎng)的PVSMC都有TRPC的mRNA表達,其中以TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6,尤其是TRPC-1和TRPC-6的mRNA表達最強。Western-blot免疫印跡分析進一步表明,在大鼠遠端肺靜脈平滑肌組織和培養(yǎng)的PVSMC都有TRPC蛋白的表達,且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表達最強。 3、在去除細胞外Ca~(2+)、用硝苯地平阻斷VDCC并用CPA使Ca~(2+)從PVSMC肌漿網(wǎng)完全清空的條件下,恢復PVSMC細胞外Ca~(2+)后, PVSMC [Ca~(2+)]_i可迅速顯著升高;在去除細胞外Ca~(2+)并用硝苯地平阻斷VDCC的條件下,CPA使Mn~(2+)引起的PVSMC的熒光q 滅增強;作為SOCC拮抗劑,SKF-96365和NiCl2均能明顯抑制由CPA誘導的PVSMC [Ca~(2+)]_i升高和錳熒光q 滅增強,但對高鉀KRBS溶液引起的PVSMC [Ca~(2+)]_i升高沒有影響,提示大鼠遠端PVSMC存在SOCE。 4、急性低氧能顯著增加由CPA誘導的、恢復細胞外鈣后所引起的大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i升高,并能增強由CPA誘導的大鼠遠端PVSMC的錳熒光q 滅; SKF-96365和NiCl2均能明顯抑制急性低氧引起的大鼠遠端PVSMC的SOCE增加;在常氧情況下,用不含CPA但含有硝苯地平的無鈣溶液孵育PVSMC,錳熒光q 滅與不加Mn~(2+)的細胞的熒光自發(fā)衰減量沒有差異;而在急性低氧情況下,用不含CPA但含有硝苯地平的無鈣溶液孵育PVSMC,錳熒光q 滅顯著增加,而且此反應能被SKF-96365和NiCl2明顯抑制,提示急性低氧自身能誘發(fā)大鼠遠端PVSMC的SOCE,而且能夠通放大SOCE,引起PVSMC [Ca~(2+)]_i升高。 三、慢性低氧對大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i的影響: 1、成功建立CHPH大鼠模型,慢性持續(xù)性低氧3周大鼠的MPAP、RVSP、RV/(LV+S)都明顯增高,肺內(nèi)血管壁明顯增厚。 2、CHPH大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i較正常大鼠明顯增高,提示慢性低氧使大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高。 四、慢性低氧對大鼠遠端PVSMC[Ca~(2+)]_i影響的機制: 1、熒光定量PCR和western-blot免疫印跡分析證實:在CHPH大鼠遠端肺靜脈平滑肌組織TRPC-6蛋白的表達較正常大鼠明顯增強,而TRPC-1和TRPC-4蛋白的表達較正常大鼠沒有明顯改變,提示慢性低氧上調(diào)大鼠遠端肺靜脈平滑肌組織TRPC-6蛋白的表達。 2、用硝苯地平阻斷VDCC并恢復細胞外Ca~(2+)后,CPA不僅能導致CHPH大鼠遠端PVSMC [Ca~(2+)]_i迅速升高,而且能使正常大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i也迅速升高,兩者升高幅度無差別;用含CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育細胞,CHPH大鼠遠端PVSMC的錳熒光q 滅與正常大鼠的也無差別。然而,用硝苯地平阻斷VDCC并恢復細胞外Ca~(2+)后,OAG能使正常大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高,而CHPH大鼠遠端PVSMC由OAG誘導的[Ca~(2+)]_i升高較正常大鼠更明顯;同時,OAG誘導的錳熒光q 滅在CHPH大鼠遠端PVSMC也比正常大鼠表現(xiàn)的更強,提示慢性低氧通過增加由ROCC介導的Ca~(2+)內(nèi)流使大鼠遠端PVSMC的[Ca~(2+)]_i升高。 結論 1、急性和慢性低氧都能使大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高。 2、大鼠遠端肺靜脈平滑肌主要表達TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6,尤以TRPC-1和TRPC-6為主;大鼠遠端肺靜脈平滑肌存在SOCE。 3、急性低氧不僅自身能夠誘發(fā)大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞的SOCE,而且能夠放大SOCE,從而引起細胞內(nèi)鈣濃度升高。 4、慢性低氧能夠上調(diào)大鼠遠端肺靜脈平滑肌TRPC-6的表達,使主要由TRPC-6蛋白組成的ROCC增加,導致由ROCC介導的Ca~(2+)內(nèi)流增加,從而引起細胞內(nèi)鈣濃度升高。
【學位單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R543.2;R563.9
【部分圖文】：

圖 1-1： 倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的大鼠遠端 PVSMC 100×A.大鼠遠端 PVSMC 接種后 3 天內(nèi)開始分裂生長，細胞呈長梭形，細胞中間凸起的部分含有細胞核。B.當細胞進一步生長達較密融合時，細胞呈簇狀生長。C.細胞進一步融合，并行排列呈束生長。D.當細胞完全融合時，細胞表現(xiàn)出典型的血管平滑肌細胞生長的特點，即“峰谷”狀生長。27

圖 1-2： 大鼠遠端 PVSMC α-actin 免疫熒光染色 400×A.大鼠遠端 PVSMC α-actin 免疫熒光染色呈陽性反應，可見非常典型的、直的、無電纜樣纖維沿細胞長軸并行排列。B.當 PVSMC 進一步融合，細胞質(zhì)中填滿強陽性反應的蛋白纖維。C.無一抗孵育的對照組 PVSMC，α-actin 免疫熒光染色呈陰性反應。D.PVSMC 對 Von Willebrand 因子免疫熒光染色呈陰性反應。E.HUVEC 對 Von Willebrand 因子免疫熒光染色呈陽性反應。F.無一抗孵育的 HUVEC 對 Von Willebrand 因子免疫熒光染色呈陰性反應。28

圖 1-3： 大鼠遠端 PVSMC α-actin 蛋白 Western 印跡結果 10 15 20 25controlKCLKCL+Nifed050100150200250ΔC[a+2]in(M)B＊

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 曹平安;血管內(nèi)皮生長因子對血管內(nèi)皮細胞鎂離子濃度的影響[D];遵義醫(yī)學院;2011年

本文編號：2809336