發(fā)布時(shí)間：2020-08-31 15:53

　　 革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是內(nèi)毒素的主要成份,也是引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和肺纖維化的重要致病因素。LPS能誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞異常增殖活化并分泌膠原蛋白沉積于肺組織,引起肺纖維化,但相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)研究提示肺成纖維細(xì)胞自噬抑制過(guò)程與肺纖維化進(jìn)程密切相關(guān),但目前尚未明確在LPS誘導(dǎo)的肺纖維化過(guò)程中是否存在肺成纖維細(xì)胞自噬抑制過(guò)程,對(duì)其相關(guān)調(diào)控機(jī)制也尚未明了。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LPS可活化肺成纖維細(xì)胞PI3K-Akt通路引起細(xì)胞增殖,而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt-m TOR通路是調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程的重要途徑,本課題組由此推測(cè)LPS可能通過(guò)活化PI3K-Aktm TOR信號(hào)通路抑制肺成纖維細(xì)胞自噬過(guò)程,而肺成纖維細(xì)胞自噬抑制可能與LPS誘導(dǎo)的肺纖維化過(guò)程密相關(guān)。目的本研究利用LPS抑制肺成纖維細(xì)胞自噬模型,深入研究LPS抑制肺成纖維細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其內(nèi)在機(jī)制,明確PI3K-Akt-m TOR信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用,為進(jìn)一步豐富和完善LPS致肺纖維化的發(fā)病機(jī)理、探索該病的防治手段奠定基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)小鼠原代肺成纖維細(xì)胞,通過(guò)Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LPS刺激后肺成纖維細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白的表達(dá),明確LPS對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞自噬的影響;繼而以Western Blot技術(shù)檢測(cè)LPS刺激后PI3K-Akt-m TOR通路蛋白Akt和m TOR的活化情況,并分別以m TOR信號(hào)分子抑制劑雷帕霉素和PI3K-Akt通路抑制劑Ly294002預(yù)處理后,以Western Blot、免疫熒光技術(shù)和透射電子顯微鏡技術(shù)檢測(cè)LPS刺激后肺成纖維細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt-m TOR通路相關(guān)蛋白Akt和m TOR的活化情況、自噬相關(guān)蛋白LC3和SQSTM1/p62的表達(dá)以及自噬小體的形成情況,以明確PI3K-Aktm TOR通路在LPS抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞自噬過(guò)程中的作用。結(jié)果1.以LPS刺激小鼠肺成纖維細(xì)胞后可引起自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)和LC3-II/I的比值下降。2.以LPS刺激小鼠肺成纖維細(xì)胞后可上調(diào)與自噬水平呈負(fù)相關(guān)的SQSTM1/p62蛋白的表達(dá)量,并抑制細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成,同時(shí)促進(jìn)PI3KAkt-m TOR通路相關(guān)蛋白Akt和m TOR的磷酸化。而予m TOR信號(hào)分子抑制劑雷帕霉素預(yù)處理后,可抑制由LPS刺激引起的SQSTM1/p62蛋白表達(dá)增高過(guò)程并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成,逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制過(guò)程;予PI3KAkt通路抑制劑Ly294002預(yù)處理后,可抑制LPS刺激引起的m TOR蛋白磷酸化和SQSTM1/p62蛋白表達(dá)增高過(guò)程并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成,從而逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制過(guò)程。結(jié)論LPS能抑制肺成纖維細(xì)胞自噬,PI3K-Akt-m TOR通路活化可介導(dǎo)LPS引起的肺成纖維細(xì)胞自噬抑制過(guò)程。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

LPS刺激降低小鼠肺成纖維細(xì)胞Lc3一!1/1蛋白的比值

表 1 四組小鼠肺成纖維細(xì)胞 LC3-I、LC3-II 和 Beclin1 的蛋白表達(dá)灰（ x ±s）組別 樣本例數(shù) LC3-II/I BeclinCon. 3 1.96±0.26 0.71±LPS2503 1.75±0.15 0.65±LPS5003 1.54±0.21 0.66±LPS10003 1.22±0.23* 0.45±注：與 Con.組比較，*P<0.05。

LPS抑制小鼠肺成纖維細(xì)胞Lc3蛋白表達(dá)Fl公”re3LPSlnhilll撫dLC3exPressioninmouse】11們g右hroblasts注:以IO00ngll力L濃度的LPs刺激小鼠肺成纖維細(xì)胞30h后，以紅色熒光Cy3對(duì)細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白進(jìn)免疫熒光染?

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉詩(shī)o

本文編號(hào)：2809013