發(fā)布時(shí)間：2020-08-31 10:24

　　 1.研究背景急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的特征是肺泡-毛細(xì)血管屏障的彌漫性損傷、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、富含蛋白質(zhì)的肺泡水腫液和嚴(yán)重的氣體交換異常。盡管經(jīng)過(guò)了50多年臨床和基礎(chǔ)的研究,ARDS仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。ARDS不僅增加醫(yī)療成本并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,而且死亡率很高。因此,迫切需要深入了解ARDS的發(fā)病機(jī)制。中性粒細(xì)胞(PMNs)作為先天免疫細(xì)胞對(duì)控制感染起到至關(guān)重要的作用。在ARDS發(fā)病過(guò)程中,循環(huán)PMNs被激活并穿透肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)入肺泡。PMNs在肺泡炎性微環(huán)境中進(jìn)一步活化,發(fā)揮吞噬病原體、釋放活性氧和中性粒細(xì)胞胞外陷阱的重要作用�；罨闹行粤＜�(xì)胞進(jìn)一步導(dǎo)致肺泡損傷和肺功能的喪失。然而,ARDS循環(huán)PMNs活化的機(jī)制仍然知之甚少。近十年來(lái),高通量檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展為ARDS轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究提供了技術(shù)支持。然而,既往高通量研究存在一個(gè)問(wèn)題:檢測(cè)樣本是全血或總白細(xì)胞而不是純化的中性粒細(xì)胞。本研究中,為了鑒定ARDS特異性中性粒細(xì)胞表型,我們分析了GSE76293數(shù)據(jù)集ARDS患者循環(huán)PMNs和GSE4975數(shù)據(jù)集暴露于嚴(yán)重膿毒癥患者血漿的PMNs的差異表達(dá)基因(DEGs)。利用生物信息學(xué)方法,我們鑒定了ARDS特異性循環(huán)中性粒細(xì)胞表型的關(guān)鍵通路和基因。2.研究目的本研究的目的是鑒定ARDS特異性循環(huán)中性粒細(xì)胞表型的關(guān)鍵通路和基因,為ARDS的診斷和治療提供新的思路。3.研究方法3.1芯片數(shù)據(jù)我們?cè)贕EO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索ARDS和膿毒癥血液PMN的表達(dá)譜,最終篩選得到數(shù)據(jù)集GSE76293和GSE49757。我們選擇GSE76293數(shù)據(jù)集12例ARDS患者循環(huán)PMNs樣本與12例健康志愿者(HVT)循環(huán)PMNs樣本;同時(shí)選擇GSE49757數(shù)據(jù)集20例嚴(yán)重膿毒癥血漿刺激的PMN樣本與19例HVT血漿刺激的PMN樣本用于差異分析。3.2差異表達(dá)基因的鑒定使用GE02R軟件分析GSE76293和GSE49757中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因(DEGs),其中篩選標(biāo)準(zhǔn)是adj p0.01和|log2差異倍數(shù)|1。使用維恩圖軟件分析GSE49757和GSE76293 DEGs的交集。3.3基因本體論(GO)和信號(hào)通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析DEGs的功能和通路富集情況。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和功能模塊分析使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)DEGs之間的相互作用,然后使用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件CytoNCA和MCODE插件鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)的功能模塊和核心(hub)基因。3.5轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析使用Cytoscape的iRegulon插件預(yù)測(cè)PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因的TFs。閾值設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(NES)4。3.6核心基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的驗(yàn)證為了分析GSE49757和GSE76293中7個(gè)核心基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,我們從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載兩個(gè)數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)log2標(biāo)準(zhǔn)化處理后使用GraphPad Prism 7.04統(tǒng)計(jì)分析并繪制箱式圖。3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用GraphPad Prism 7.04(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。兩組數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均以平均值± SEM表示,p0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.研究結(jié)果4.1差異表達(dá)基因的鑒定在GSE76293中,與HVT血液PMNs相比,總共有1120個(gè)DEGs在ARDS血液PMNs中顯著差異表達(dá)。在GSE49757中,與未感染的對(duì)照相比,總共有971個(gè)DEGs在暴露于嚴(yán)重膿毒癥患者血漿的PMNs中顯著差異表達(dá)。GSE49757和GSE76293 DEGs存在220個(gè)重疊基因。4.2基因本體論(GO)和信號(hào)通路富集分析GSE76293中DEGs主要參與以下生物學(xué)過(guò)程:凋亡過(guò)程、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)和白三烯信號(hào)傳導(dǎo)通路。GSE76293中DEGs主要富集在以下通路:MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路。GSE49757中DEGs主要與以下生物學(xué)過(guò)程相關(guān):炎癥反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過(guò)程、免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)。GSE49757中DEGs主要富集在以下通路:NF-κ B信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路。4.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape軟件構(gòu)建了具有899個(gè)節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),并利用MCODE和CytoNCA插件分析PPI網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊和核心基因。最終我們鑒定了30個(gè)核心基因和3個(gè)最重要的功能模塊。其中,GAPDH、AKT1、MAPK14、MAPK8、IL8、PIK3CB和MMP9是三個(gè)功能模塊的核心基因。4.4轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析使用Cytoscape軟件iRegulon插件預(yù)測(cè)了PPI網(wǎng)絡(luò)中前50個(gè)核心基因的TFs。當(dāng)設(shè)定閾值NES4時(shí),篩選到6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(E2F1、NFKB1、NFYA、PBX3、EGR1、RELA)及其30個(gè)靶向基因。4.5核心基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的驗(yàn)證本研究比較了 GSE49757和GSE76293中7個(gè)核心基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GSE49757和GSE76293中,AKT1和IL8均被下調(diào),MAPK14均被上調(diào);而GAPDH、MAPK8、PIK3CB和MMP9相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)不同。5.結(jié)論我們鑒定了參與ARDS特異性中性粒細(xì)胞表型的關(guān)鍵通路和基因。MAPK8、PIK3CB和MMP9可能在ARDS特異性循環(huán)中性粒細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)可能為急性呼吸窘迫綜合征的診斷和治療提供新的視角。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R563.8
【部分圖文】：

圖１－１邋ＧＳＥ４９７５７和ＧＳＥ７６２９３差異表達(dá)基因聚類圖、火山圖和維恩圖。Ａ：逡逑ＧＳＥ７６２９３基因表達(dá)譜聚類圖，紅色到藍(lán)色代表從高到低的ｍＲＮＡ表達(dá)水平。Ｂ：逡逑ＧＳＥ７６２９３差異表達(dá)基因火山圖，灰點(diǎn)表示沒(méi)有變化，藍(lán)點(diǎn)和紅點(diǎn)分別表示下調(diào)逡逑和上調(diào)基因。Ｃ：維恩圖顯示ＧＳＥ４９７５７和ＧＳＥ７６２９３之間ＤＥＧｓ交集。逡逑

圖１－３邋ＧＳＥ７６２９３中基于８９９?

圖１－４邋ＧＳＥ７６２９３邋ＰＰＩ網(wǎng)絡(luò)最重要的３個(gè)功能模塊

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