發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 21:22

【摘要】：目的:探討皮層肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽(Cortactin)對(duì)剪應(yīng)力(SS)誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞黏液高分泌的影響,并試圖明確該介導(dǎo)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。方法:1、體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞16HBE,并將細(xì)胞隨機(jī)分為6組:A:空白對(duì)照組;B:SS組;C:SS+野生型Cortactin組;D:SS+pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU組;E:SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU組;F:SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU組;2、分別轉(zhuǎn)染野生型Cortactin及已構(gòu)建好的Cortactin各型突變體pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU、SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU、SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU。采用蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)每組細(xì)胞Cortactin蛋白的表達(dá)水平,用轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比,明確各組細(xì)胞載體成功轉(zhuǎn)染后,方可行后續(xù)步驟。3、實(shí)驗(yàn)的刺激因素為旋轉(zhuǎn)裝置產(chǎn)生的剪應(yīng)力,為確保能成功構(gòu)建黏液高分泌模型,旋轉(zhuǎn)裝置的運(yùn)行參數(shù)為:30轉(zhuǎn)/分,作用時(shí)間30min。4、用Western blot觀察各組細(xì)胞p-Cortactin蛋白表達(dá)水平,ELISA測(cè)定各組細(xì)胞黏蛋白MUC5AC蛋白量,RT-PCR法觀測(cè)各組裂解細(xì)胞MUC5ACmRNA水平。轉(zhuǎn)染Cortactin各定點(diǎn)突變體,比較剪應(yīng)力作用后各組細(xì)胞中不同磷酸化Cortactin蛋白的含量以及各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC含量的差別,推斷出Cortactin介導(dǎo)MUC5AC分泌的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。結(jié)果:1、轉(zhuǎn)染野生型Cortactin及已構(gòu)建好的Cortactin各型突變體后Cortactin蛋白水平較對(duì)照組明顯升高(p0.01),說(shuō)明載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。2、與空白對(duì)照組相比,在SS刺激下,p-Cortactin水平、MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平、MUC5AC蛋白分泌量顯著增加(均為p0.01)。3、與單純SS刺激組相比,SS+野生型Cortactin組細(xì)胞的p-Cortactin蛋白、粘蛋白MUC5AC表達(dá)亦顯著增加(分別為p0.01,p0.05)。4、與SS+野生型Cortactin組相比,SS+pcDNA3-Cortactin ~(466)-MU組的p-Cortactin蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)上清液MUC5AC的相對(duì)分泌量顯著下降(p值均0.01),但MUC5AC的轉(zhuǎn)錄水平未受明顯影響(p0.05);但SS+pcDNA3-Cortactin ~(421)-MU組和SS+pcDNA3-Cortactin ~(482)-MU組的p-Cortactin蛋白、MUC5AC mRNA表達(dá)、培養(yǎng)上清液MUC5AC的分泌量較SS+野生型Cortactin組均無(wú)顯著差異(p0.05)。結(jié)論:在剪應(yīng)力刺激誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞MUC5AC高分泌過(guò)程中,Cortactin具有重要的介導(dǎo)作用,酪氨酸磷酸化位點(diǎn)Y466突變后,MUC5AC的分泌將受到明顯阻斷。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R56
【圖文】：

圖 2.1 各組細(xì)胞 Cortactin 的相對(duì)表達(dá)水平A. Control group; B. wild-Cortactin group C. pcDNA3- Cortactin4D. pcDNA3- Cortactin466-MU group; E. pcDNA3- Cortactin482-MNote: *P<0.01 compared with control group.細(xì)胞 p-Cortactin 水平表達(dá)情況 印跡法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，單純剪應(yīng)力（SS）刺激下，p-cortac組顯著升高（p<0.01），說(shuō)明氣道剪應(yīng)力可促進(jìn) Cortactin 蛋 刺激組相比，轉(zhuǎn)染野生型 Cortactin 后，再予 SS 刺激，p顯增加（p<0.01）；與 SS+野生型 Cortactin 組相比，SS+pcDN的 p-Cortactin 蛋白水平顯著下降（p<0.01），而 SS+pcDN和 SS+pcDNA3- Cortactin482-MU 組的 p-Cortactin 蛋白水平5）（表 2.2、圖 2.2）。表 2.2 各組細(xì)胞 p-Cortactin 的相對(duì)表達(dá)水平( ，n=6)

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