【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是危害人類健康的重大疑難疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜又相互影響,其中炎癥反應(yīng)在COPD發(fā)病過程中起著重要作用。阻抑炎癥反應(yīng)是減輕癥狀,提高COPD防治水平,延緩疾病進(jìn)展的重要手段。COPD的炎癥反應(yīng)涉及多個(gè)細(xì)胞因子、多種細(xì)胞類型以及多條信號(hào)通路,從而形成COPD炎癥分子網(wǎng)絡(luò),對(duì)COPD分子網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵細(xì)胞因子及核心信號(hào)通路的研究有助于更好地闡明中醫(yī)藥治療COPD的作用機(jī)制及特點(diǎn)。本文就觀察腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549分泌炎癥因子和信號(hào)通路核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)、過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)的激活情況,篩選并優(yōu)化COPD體外炎癥模型,研究調(diào)補(bǔ)肺腎三法(補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)下A549細(xì)胞對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用,探討中醫(yī)藥阻抑COPD炎癥的分子生物學(xué)機(jī)制。目的以TNF-α、LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞篩選并優(yōu)化A549細(xì)胞體外炎癥模型,觀察其分泌炎癥因子的情況以及對(duì)NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(Nuclear transcription factor activator protein-1,AP-1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transciption-3,STAT3)、過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)活性的影響,篩選其靶通路,探討調(diào)補(bǔ)肺腎三法(補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方)對(duì)A549細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用,為揭示調(diào)補(bǔ)肺腎三法阻抑COPD炎癥反應(yīng)的分子作用機(jī)制提供依據(jù)。方法1篩選并優(yōu)化A549細(xì)胞體外炎癥模型MTT檢測(cè)TNF-α不同濃度(5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L、40ng/m L)誘導(dǎo)A549細(xì)胞不同作用時(shí)間(6h、12h、24h、48h、72h)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;MTT檢測(cè)LPS不同濃度(0.25μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L)不同作用時(shí)間(6h、12h、24h、48h、72h)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。ELISA檢測(cè)20ng/m L TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h后上清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、黏蛋白5AC(MUC5AC)等細(xì)胞因子的分泌情況;ELISA檢測(cè)1μg/m L、2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6h、12h、24h、48h后上清中IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-9等細(xì)胞因子的分泌情況。凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)10ng/m L、20ng/m L TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h、48h后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情況;EMSA檢測(cè)2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情況。2含藥血清制備普通級(jí)日本大耳白兔96只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組和益氣滋腎組。分別用生理鹽水、補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方灌胃,于第7次灌胃后1h腹主動(dòng)脈采血,離心分離血清,過濾分裝,56℃、30min滅活后,-80℃保存所得含藥血清。3觀察調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)信號(hào)通路NF-κB的影響根據(jù)以上模型篩選結(jié)果,分組干預(yù)細(xì)胞:分為空白血清組、模型組、補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組、益氣滋腎組,每組血清又分為低(10%)、中(20%)、高(40%)三個(gè)濃度,取上述相同指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。之后添加信號(hào)通路NF-κB抑制劑二硫氨基甲酸肽吡咯烷(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)組,EMSA檢測(cè)A549中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。結(jié)果1篩選并優(yōu)化A549細(xì)胞體外炎癥模型1.1 TNF-α、LPS對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與正常對(duì)照組相比,TNF-α在誘導(dǎo)A549細(xì)胞12h后,40ng/m L組OD值降低有顯著性差異(p0.01);在誘導(dǎo)24h后,TNF-α10ng/m L、20ng/m L、40ng/m L組OD值降低(p0.05);在誘導(dǎo)48h后,TNF-α20ng/m L組OD值降低(p0.05)。與正常對(duì)照組相比,0.25-2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6-72h,細(xì)胞OD值的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。1.2 TNF-α、LPS對(duì)A549細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響與正常對(duì)照組相比,20ng/m L TNF-α組細(xì)胞因子MMP-9、MMP-3、TNF-α、IL-8、MUC5AC分泌水平顯著升高(p0.05,p0.01);余細(xì)胞因子TIMP-1、TIMP-1/MMP-9、IL-10、TIMP-1、IL-4分泌水平升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與正常對(duì)照組相比,2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞12h時(shí)細(xì)胞因子IL-6和IL-8分泌增多(p0.05);1μg/m L、2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6h MMP-9分泌減少(p0.05),2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞48h時(shí)MMP-9分泌減少(p0.05);1μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)TNF-α分泌減少(p0.05);1μg/m L、2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6-48h時(shí)TIMP-1分泌顯著減少(p0.01)。1μg/m L、2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6-48h時(shí)炎癥因子IL-10、MUC5AC分泌水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。1.3 TNF-α、LPS對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、PPAR、STAT3活性的影響與正常對(duì)照組相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增強(qiáng),以20ng/m L組最為顯著(p0.01),20ng/m L TNF-α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞48h時(shí)NF-κB活性減弱(p0.01)。與正常對(duì)照組相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性增強(qiáng),以20ng/m L組最為顯著(p0.01)。與正常對(duì)照組相比,10ng/m L、20ng/m L TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h、48h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子PPAR、STAT3活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2μg/m L LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)AP-1、PPAR、STAT3活性減弱(p0.05),NF-κB活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎癥模型的NF-κB信號(hào)通路的影響2.1調(diào)補(bǔ)肺腎三法不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞A549生長(zhǎng)的影響與正常對(duì)照組相比,20%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組、益氣滋腎組)OD值明顯升高(p0.01,p0.05);與模型組相比,20%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清組OD值明顯升高(p0.01,p0.05),40%補(bǔ)肺健脾組OD值降低(p0.05),余濃度含藥血清OD值變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.2調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8、MMP-9、TNF-α的影響與20%空白血清組比較,模型組、調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組)及PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞因子IL-8、MMP-9、TNF-α分泌顯著增多(p0.01)。與20%模型組比較,益氣滋腎組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)IL-8分泌增多(p0.05),補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組MMP-9分泌顯著增多(p0.01),補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組TNF-α分泌增多(p0.05,p0.01),補(bǔ)肺健脾組TNF-α分泌減少(p0.05)。與40%空白血清組比較,模型組、調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組)及PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)IL-8分泌增多(p0.01),模型組、補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組MMP-9分泌增多(p0.01),模型組TNF-α分泌增多(p0.01)。與40%模型組比較,調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組)誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)TNF-α分泌顯著減少(p0.01);調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組)及PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)IL-8分泌減少(p0.05);益氣滋腎組、PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)MMP-9分泌減少(p0.05,p0.01),補(bǔ)肺益腎、補(bǔ)肺健脾組MMP-9分泌有減少趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.3調(diào)補(bǔ)肺腎三法及抑制劑PDTC含藥血清對(duì)A549細(xì)胞NF-κB通路活性的影響與空白血清組相比,40%模型組血清(20ng/m L TNF-α)誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增強(qiáng)(p0.05)。與模型組相比,40%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清(補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組)及PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性減弱有顯著性差異(p0.01)。與空白血清組相比,10%、20%模型組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性有增強(qiáng)趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且與模型組相比,10%、20%調(diào)補(bǔ)肺腎三方血清組及PDTC組轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性減弱無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1.TNF-α可使A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-8、MMP-9等炎癥因子,能夠激活NF-κB、MAPK信號(hào)通路,可使用TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞作為A549細(xì)胞體外炎癥模型。2.確立了優(yōu)化TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞的條件,20ng/m L TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h作為細(xì)胞炎癥模型是適宜的。3.LPS對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小,對(duì)細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、MMP-9等炎癥因子及NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR通路的活性的影響不顯著,LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞不適于建立細(xì)胞炎癥模型。4.調(diào)補(bǔ)肺腎三法(補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方)均可明顯下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞分泌炎癥因子IL-8、MMP-9、TNF-α水平,減弱轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。調(diào)補(bǔ)肺腎三法調(diào)控NF-κB信號(hào)通路以阻抑炎癥反應(yīng)可能是其治療COPD的分子機(jī)制之一,具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：2801259