【摘要】：機(jī)械通氣對(duì)于臨床救治危重癥患者具有其他療法所無可替代的作用。然而，機(jī)械通氣本身也可作為一種損傷因素誘發(fā)或加重肺損傷，稱為呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。VILI是機(jī)械通氣過程中的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥，也是促使患者病情加重和死亡的重要原因。因此，機(jī)械通氣如使用不當(dāng)不但起不到應(yīng)有的治療作用，還會(huì)釀成嚴(yán)重后果，導(dǎo)致通氣治療失敗，給人民生命財(cái)產(chǎn)造成巨大損失。 大量研究已經(jīng)證明機(jī)械通氣壓力過高、潮氣量過大可誘發(fā)和加重肺損傷。然而在臨床上，雖然我們不可能給患者設(shè)置過大的、足以引起肺組織損傷的潮氣量，但常規(guī)潮氣量通氣是否絕對(duì)安全，對(duì)正常肺組織能否造成炎癥性損傷目前尚有爭(zhēng)議。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，高氣道峰壓(PIP)和大潮氣量(V_T)通氣可使中性粒細(xì)胞(PMN)激活。PMN活化后不但能釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，還可生成大量氧自由基和蛋白水解酶等，這是造成肺組織炎癥性損傷的主要原因。然而在VILI的發(fā)病過程中，PMN并非是唯一的參與細(xì)胞，也不是引起肺組織炎癥性損傷的始動(dòng)細(xì)胞，其活化依賴于肺內(nèi)其他前炎細(xì)胞因子的釋放。 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)是1988年Wolpe等用LPS刺激巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)，在其上清液中首次發(fā)現(xiàn)的新型蛋白質(zhì)，包括MIP-1、MIP-2、MIP-3、MIP-4和MIP-5。其中MIP-1和MIP-2與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，具有廣泛的生物學(xué)活性，不但參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，還具有抗腫瘤作用、促進(jìn)造血功能和損傷修復(fù)作用。Murch等對(duì)30例ARDS患兒行支氣管肺泡灌洗，發(fā)現(xiàn)其BALF上清液中MIP-1α濃度明顯高于對(duì)照組，經(jīng)地塞米松治療12～24小時(shí)后其濃度明顯降低。但MIP-1α在VILI的發(fā)生中是否也具有類似作用，目前尚未見到文獻(xiàn)報(bào)道。 核因子-κB(NF-κB)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的特異性DNA結(jié)合蛋白，是由Rel蛋白家族中兩個(gè)亞單位構(gòu)成的二聚體復(fù)合物，其中由p65和p50組成的異源二聚體最有代表性。正常時(shí)NF-κB存在于細(xì)胞漿內(nèi)，并與抑制性亞基I-κB結(jié)合處于失活狀態(tài)。在各種致病因素作用下，I-κB發(fā)生磷酸化而與NF-κB脫離，即可導(dǎo)致NF-κB激活。后者異位進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA上特異位點(diǎn)相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，NF-κB可通過調(diào)控肺部多種細(xì)胞因子和粘附分子如白介素-1β(IL-1β)、TNF-α、IL-6、IL-8、ICAM-1和選擇素E等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與機(jī)體的免疫及炎癥反應(yīng)。但NF-κB是否參與調(diào)控VILI時(shí)肺部MIP-1α基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)目前尚無定論，有待進(jìn)一步研究。 肺泡巨噬細(xì)胞(AM)是肺內(nèi)局部炎癥反應(yīng)的主要始動(dòng)細(xì)胞，不但具有強(qiáng)大的吞噬功能，激活后還能合成和分泌多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致肺臟局部炎癥反應(yīng)失控，是造成ALI的重要原因。Takata等通過在體家兔肺損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，AM活化并釋放TNF-α、IL-1β及IL-8等前炎細(xì)胞因子在中性粒細(xì)胞活化中起重要作用。Hirani等研究表明，在參與ALI／ARDS發(fā)病的眾多細(xì)胞因子中，IL-8是中性粒細(xì)胞向肺內(nèi)募集最強(qiáng)的趨化因子，它可由AM產(chǎn)生，也可由其他細(xì)胞產(chǎn)生，并受局部組織氧合狀態(tài)調(diào)節(jié)。但AM在VILI的發(fā)病中究竟扮演什么角色，目前尚不清楚。 鑒于當(dāng)前VILI的研究基礎(chǔ)與現(xiàn)狀，本研究將通過肉眼、光鏡和電鏡對(duì)不同潮氣量機(jī)械通氣大鼠的肺組織進(jìn)行觀察，并測(cè)定其動(dòng)脈血?dú)夥治�，測(cè)定BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、髓過氧化物酶(MPO)活性以及MIP-1α和蛋白含量，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交技術(shù)測(cè)定其肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞MIP-1α和NF-κB基因及其蛋白表達(dá)水平，以從分子水平上探討不同潮氣量機(jī)械通氣致大鼠急性肺損傷的發(fā)生機(jī)制，從而為VILI的臨床防治提供新的線索。 一、研究?jī)?nèi)容 本研究?jī)?nèi)容包括3部分： 第一部分：呼吸機(jī)所致大鼠急性肺損傷的病理學(xué)改變 第二部分：中性粒細(xì)胞活化在呼吸機(jī)致大鼠急性肺損傷中的作用 第三部分：巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α在呼吸機(jī)致大鼠急性肺損傷中的作用 二、研究方法 1．Wistar大鼠32只(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，體重300～310g，隨機(jī)分為4組：①對(duì)照組：未行機(jī)械通氣；②小潮氣量組：V_T 7ml／kg；③常規(guī)潮氣量組：V_T 12ml／kg；④大潮氣量組：V_T 40ml／kg。 2．在肉眼、光鏡和電鏡下對(duì)不同潮氣量機(jī)械通氣致大鼠急性肺損傷的病理改變進(jìn)行觀察。 3．測(cè)定各組大鼠肺濕／干重比值(W／D)。 4．用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治觥?5．在光鏡下行支氣管肺泡灌洗液(BALF)WBC及PMN計(jì)數(shù)。 6．按羅武生等的方法測(cè)定血漿和BALF中髓過氧化物酶(MPO)活性。 7．用雙縮脲法測(cè)定血漿蛋白含量，用考馬斯亮蘭法測(cè)定BALF蛋白含量。 8．采用ELISA法測(cè)定血漿及BALF中MIP-1α含量。 9．采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織MIP-1α蛋白表達(dá)水平。 10．采用原位分子雜交法檢測(cè)肺組織MIP-1αmRNA表達(dá)水平。 11．采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。 12．采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞MIP-1α及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。 三、研究結(jié)果 (一)各組大鼠肺臟病理學(xué)改變 結(jié)果顯示，小潮氣量組大鼠肺臟外觀基本正常，光鏡下僅見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡下觀察與對(duì)照組無明顯差別。常規(guī)潮氣量組大鼠肺臟外觀略顯腫脹，但表面色澤基本正常，光鏡下可見不同程度肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡下可見肺泡隔內(nèi)有大量電子密度較低的液狀物質(zhì)聚集。大潮氣量組大鼠肺臟外觀明顯腫脹，表面可見點(diǎn)狀出血，光鏡下可見彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡下可見肺泡上皮細(xì)胞之間以及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接受損，中性粒細(xì)胞呈功能激活狀態(tài)，表面伸出許多棘狀突起，胞漿顆粒外釋，呈空泡變。 (二)各組大鼠肺濕／干重比值(W／D)和動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，大潮氣量組和常規(guī)潮氣量組肺濕／干重比值(W／D)明顯高于對(duì)照組和小潮氣量組(P＜0.01)，而動(dòng)脈血氧分壓(PaO_2)明顯低于對(duì)照組和小潮氣量組(P＜0.01，P＜0.05)；小潮氣量組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (三)各組大鼠BALF中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，常規(guī)潮氣量組和大潮氣量組大鼠BALF中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于對(duì)照組和小潮氣量組(P＜0.001)，對(duì)照組和小潮氣量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (四)各組大鼠血漿及BALF中MPO活性測(cè)定結(jié)果結(jié)果顯示，常規(guī)潮氣量組和大潮氣量組大鼠BALF中MPO活性均明顯高于對(duì)照組和小潮氣量組(P＜0.01，P＜0.05)；大潮氣量組大鼠BALF中MPO活性明顯高于常規(guī)潮氣量組(P＜0.01)；對(duì)照組和小潮氣量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿MPO活性間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (五)各組大鼠血漿及BALF中蛋白含量測(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，常規(guī)潮氣量組和大潮氣量組大鼠BALF中蛋白含量均明顯高于對(duì)照組和小潮氣量組(P＜0.01)；大潮氣量組大鼠BALF中蛋白含量明顯高于常規(guī)潮氣量組(P＜0.01)；對(duì)照組和小潮氣量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿蛋白含量間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (六)各組大鼠血漿和BALF中MIP-1α含量測(cè)定結(jié)果 結(jié)果顯示，常規(guī)潮氣量組和大潮氣量組大鼠BALF中MIP-1α含量均明顯高于小潮氣量組和對(duì)照組(P＜0.01)；小潮氣量組與對(duì)照組比較以及常規(guī)潮氣量組與大潮氣量組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿中MIP-1α含量間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，各組大鼠BALF中MIP-1α含量與MPO活性及PMN計(jì)數(shù)間均呈正相關(guān)(r=0.454，P＜0.05：r=0.431，P＜0.05)。 (七)各組大鼠肺組織MIP-1α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 結(jié)果顯示，大潮氣量組和常規(guī)潮氣量組細(xì)支氣管和肺泡上皮細(xì)胞MIP-1α蛋白表達(dá)水平均比小潮氣量組與對(duì)照組明顯增高(P＜0.01)；小潮氣量組細(xì)支氣管及肺泡上皮細(xì)胞MIP-1α蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。除細(xì)支氣管上皮和肺泡上皮細(xì)胞外，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞也可見少量MIP-1α蛋白陽性表達(dá)。 (八)各組大鼠肺組織MIP-1αmRNA原位雜交及NF-κB p65蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 結(jié)果顯示，大潮氣量組和常規(guī)潮氣量組細(xì)支氣管上皮MIP-1αmRNA陽性表達(dá)細(xì)胞百分比，以及NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比均明顯高于小潮氣量組和對(duì)照組(P＜0.01)；小潮氣量組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，各組大鼠細(xì)支氣管上皮MIP-1αmRNA陽性表達(dá)細(xì)胞百分比與NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比之間呈正相關(guān)(r=0.482、P＜0.05)。 (九)各組大鼠BALF中肺泡巨噬細(xì)胞MIP-1α及NF-κB p65蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定結(jié)果 結(jié)果表明，大潮氣量組和常規(guī)潮氣量組大鼠BALF中肺泡巨噬細(xì)胞MIP-1α及NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比均明顯高于小潮氣量組和對(duì)照組(P＜0.01)；小潮氣量組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，各組大鼠BALF中肺泡巨噬細(xì)胞MIP-1α染色陽性細(xì)胞百分比與NF-κB p65蛋白核染色陽性細(xì)胞百分比之間呈正相關(guān)(r=0.457，P＜0.05)。 四、研究結(jié)論 1．小潮氣量通氣對(duì)正常肺組織無明顯損傷作用。常規(guī)潮氣量通氣對(duì)正常肺組織造成的損傷雖然在肉眼下不太明顯，但在光鏡和電鏡下可以顯示出來。大潮氣量通氣對(duì)正常肺組織所造成的損傷不僅在肉眼和光鏡下明顯可見，而且在超微結(jié)構(gòu)上也有特殊改變。提示沒有任何肺保護(hù)措施的大潮氣量和常規(guī)潮氣量機(jī)械通氣對(duì)正常肺組織有不同程度損傷作用。常規(guī)潮氣量通氣所引起的肺損傷雖不如大潮氣量通氣嚴(yán)重，但絕對(duì)不能輕視。 2．肺內(nèi)中性粒細(xì)胞募集、活化在呼吸機(jī)所致肺損傷中起重要作用，而且潮氣量越大，中性粒細(xì)胞數(shù)目越多、活性越高，對(duì)肺組織造成的損傷就越嚴(yán)重。測(cè)定血漿及BALF中蛋白含量，并計(jì)算肺泡膜通透指數(shù)(BALF蛋白含量／血漿蛋白含量)在一定程度上可反映肺組織的損傷程度，而且測(cè)定方法簡(jiǎn)單可靠，有一定實(shí)用價(jià)值。各組大鼠血漿中MPO活性及蛋白含量之間比較無明顯差異，說明呼吸機(jī)所致肺損傷在一定程度上主要表現(xiàn)在肺臟局部，而對(duì)全身影響較小。 3．巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)與VILI發(fā)生有密切關(guān)系，MIP-1α通過化學(xué)激動(dòng)和化學(xué)趨化作用促使中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集和活化，是導(dǎo)致VILI發(fā)病的重要原因之一。在VILI發(fā)病過程中，MIP-1α的來源是多途徑的，除肺泡巨噬細(xì)胞外，其他肺組織細(xì)胞也可表達(dá)MIP-1α。 4．在VILI的發(fā)生過程中，肺組織細(xì)胞釋放MIP-1α在一定程度上可能受NF-κB的調(diào)控。機(jī)械刺激→NF-κB→細(xì)胞因子信號(hào)通路可能是VILI發(fā)生過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。因此，通過阻斷NF-κB活化、減少M(fèi)IP-1α釋放和抑制中性粒細(xì)胞活性等多個(gè)環(huán)節(jié)入手進(jìn)行干預(yù)和治療，可作為VILI防治的一個(gè)新方向。 5．肺泡巨噬細(xì)胞(AM)是引起VILI的始動(dòng)細(xì)胞之一。AM活化并釋放MIP-1α是導(dǎo)致VILI發(fā)生的一個(gè)重要因素，其過程可能受NF-κB的調(diào)控。AM可直接或間接感受機(jī)械刺激信號(hào)，使細(xì)胞內(nèi)NF-κB發(fā)生活化。細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化既是AM激活的關(guān)鍵步驟，也是AM激活的重要標(biāo)志。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R563.8
【圖文】：

老丈圖1一1實(shí)驗(yàn)組大鼠肺臟大體改變 HEx400圖1一2對(duì)照組大鼠肺組織 HEx400圖1一3常規(guī)潮氣量組大鼠肺間質(zhì)呈海帶絲樣水腫改變，肺泡隔不同程度增厚 HEx400

學(xué)靂厚士學(xué)應(yīng).老丈圖1一1實(shí)驗(yàn)組大鼠肺臟大體改變 HEx400圖1一2對(duì)照組大鼠肺組織 HEx400圖1一3常規(guī)潮氣量組大鼠肺間質(zhì)呈海帶絲樣水腫改變，肺泡隔不同程度增厚 HEx400

學(xué)靂厚士學(xué)應(yīng).老丈圖1一1實(shí)驗(yàn)組大鼠肺臟大體改變 HEx400圖1一2對(duì)照組大鼠肺組織 HEx400圖1一3常規(guī)潮氣量組大鼠肺間質(zhì)呈海帶絲樣水腫改變，肺泡隔不同程度增厚 HEx400

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本文編號(hào)：2800185