發(fā)布時間：2020-08-22 01:42

【摘要】：矽肺(silicosis)亦曾稱為硅肺,是由于長期吸入大量游離二氧化硅(SiO2)粉塵所引起,以肺部廣泛纖維化為主的職業(yè)性疾病。其病變特征性改變?yōu)榉蝺任Y節(jié)形成和彌漫性間質纖維化。盡管多年來人們對矽肺的發(fā)病機制與防治研究做了大量的工作,但至今為止有關矽肺確切的發(fā)病機制仍不是十分清楚。特別是如何防治矽肺纖維化的形成與進展,一直是矽肺病研究的難點。因此,對矽肺病發(fā)病機制與防治研究也一直是職業(yè)病研究領域的重點和熱點課題。近年來研究顯示諸多細胞因子在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,它們構成了一個復雜的信號轉導的分子網絡系統。其中對轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)研究的較為深入。TGF-β是一類具有多種生物學功能的多肽類生長因子,能夠調節(jié)細胞的生長、增殖、分化和免疫功能等。TGF-β是一較強的致纖維化細胞因子,與其細胞膜型的受體,包括Ⅰ型受體(transforming growth factor-βtypeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)和Ⅱ型受體(transforming growth factor-βtypeⅡreceptor,TGF-βRⅡ)均參與了肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的信號傳遞過程。大多數資料表明,TGF-β與其膜型受體結合后才能介導細胞的信號由細胞外向細胞內的傳遞,而膜型受體活性與表達的數量也直接影響著TGF-β的生物學功能與作用。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,主要包括四類:細胞外調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated,ERK)、P38MAPK激酶(P38 mitogn-activated protein kinase,P38MAPK)、c-jun氨基末端激酶/應激激活蛋白激酶(c-jun amino-terminal kinase/stress-activated protein kinase,JNK/ SAPK)、ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1(big MAP kinase l,BMK1)。MAPK級聯是一個龐大、復雜而又精細的網絡,它參與胞外信號從細胞外轉導到細胞內的過程,是細胞內信號傳遞的主要通路之一,調節(jié)著一系列復雜的生物學功能。近期研究發(fā)現,TGF-β介導的P38絲裂原活化蛋白酶(P38 MAPK)信號轉導通路與肺纖維化的形成密切相關。 N-乙�；�-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,AcSDKP)最早是由Frindel等人于1977年從胎牛骨髓中提取的一種四肽,起初研究發(fā)現它是一種生理性造血系統的生長抑制因子,對造血功能具有一定的調節(jié)作用。隨著研究的深入,人們發(fā)現AcSDKP還能夠抑制心臟、腎臟等一些器官內的成纖維細胞的增殖和膠原的沉積,具有較為廣泛的抗器官纖維化的作用。在我們前期的實驗中也已經證實,AcSDKP能夠抑制矽肺大鼠肺內膠原的沉積,提示AcSDKP具有抗矽肺纖維化的作用。然而,其拮抗矽肺纖維化作用機制并不是十分清楚。 本實驗旨在觀察AcSDKP通過對TGF-β1介導的P38 MAPK信號轉導途徑的調節(jié)在肺成纖維細胞增殖與膠原合成中的影響,進而研究與探索AcSDKP在防治矽肺纖維化方面的作用與可能的機制。 目的: 1研究與探討TGF-β1及其受體介導的P38 MAPK信號轉導途徑在肺成纖維細胞增殖與膠原表達方面的作用。 2研究與探討AcSDKP能否通過對TGF-β1/TGF-β受體/P38 MAPK/c-myc信號轉導途徑的調節(jié)發(fā)揮其抑制肺成纖維細胞增殖與膠原表達的作用。 3為闡明AcSDKP抗矽肺纖維化的作用機制提供一定的理論及實驗依據。 方法: 1新生Wistar大鼠肺成纖維細胞的原代培養(yǎng)、傳代。第四代細胞用于實驗研究。 2實驗分組:①對照組(control):為0.4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液;②TGF-β1刺激組(TGF-β1):0.4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液中,加入終濃度為5 ng/ml TGF-β1孵育細胞45 min;③TGF-β受體阻滯劑(LY364947)干預組(LY364947):為0.4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液中,加入終濃度為59 nmol/L的LY364947預孵育3 h,再加入終濃度為5 ng/ml TGF-β1共同孵育細胞45 min;④P38 MAPK特異性抑制劑(SB203580)干預組(SB203580):為0.4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液中,加入終濃度為10 nmol/L的SB203580預孵育45 min后,再給予加入5 ng/ml TGF-β1共同孵育細胞45 min;⑤AcSDKP干預組(AcSDKP):為0.4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液中,加入終濃度為10-8 mol/L AcSDKP預孵育45 min后,再加入終濃度為5 ng/ml TGF-β1共同孵育細胞45 min。 3采用MTT法檢測大鼠肺成纖維細胞的增殖情況。 4采用Western blot法檢測大鼠肺成纖維細胞TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體、P38 MAPK、phospho-P38 MAPK、c-myc和Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達情況。 5采用免疫細胞化學法和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測大鼠肺成纖維細胞phospho-P38 MAPK蛋白的表達情況。 6采用Real-time PCR法檢測大鼠肺成纖維細胞TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體mRNA的表達情況。 7采用單因素方差分析進行組間均數的比較,以P0.05表示差異有統計學意義。 結果: 1 MTT法檢測結果顯示:與對照組比較,TGF-β1能夠促進大鼠肺成纖維細胞的增殖,而分別給予LY364947、SB203580和AcSDKP干預后,細胞增殖均受到抑制,差異具有統計學意義(P0.05)。 2 Real-time PCR結果顯示:與對照組比較,經TGF-β1刺激后,細胞的TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體mRNA的表達明顯增高,當給予LY364947和AcSDKP干預后,細胞中TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體mRNA的表達均明顯降低,差異具有統計學意義(P0.05)。而SB203580對細胞TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體mRNA的表達無明顯的抑制作用。 3 Western blot法檢測結果顯示:與對照組相比較,TGF-β1刺激組大鼠肺成纖維細胞的TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體、phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達均增強;給予LY364947干預和AcSDKP干預后,大鼠肺成纖維細胞TGF-βⅠ型、TGF-βⅡ型受體、phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達均明顯降低,差異具有統計學意義(P0.05);給予SB203580干預后,大鼠肺成纖維細胞的phospho-P38 MAPK、c-myc蛋白以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達均明顯降低,差異具有統計學意義(P0.05),而對TGF-βⅠ型受體、TGF-βⅡ型受體蛋白的表達無明顯改變;各組間P38 MAPK蛋白的表達無明顯改變(P0.05)。 4免疫細胞化學染色法檢測結果顯示:與對照組比較,TGF-β1刺激組中phospho-P38 MAPK蛋白的表達增加,與TGF-β1刺激組比較,TGF-β受體阻滯劑組、P38 MAPK特異性抑制劑組和AcSDKP干預組,phospho-P38 MAPK蛋白的表達均有所下降,差異具有統計學意義(P0.05)。 5激光掃描共聚焦顯微鏡結果顯示:與對照組比較,經TGF-β1刺激后大鼠肺成纖維細胞胞漿中phospho-P38 MAPK熒光強度降低,胞核熒光強度明顯增加。而應用LY364947、SB203580和AcSDKP進行干預后,胞漿中phospho-P38 MAPK熒光強度較TGF-β1刺激組強,而胞核中Phospho-P38 MAPK熒光強度均較TGF-β1刺激組明顯減弱,差異具有統計學意義(P0.05)。 結論: TGF-β1能夠通過其受體介導的P38 MAPK信號轉導途徑,進而誘導大鼠肺成纖維細胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。AcSDKP能夠通過阻斷TGF-β1介導的P38 MAPK信號轉導途徑,從而抑制大鼠肺成纖維細胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。這可能與AcSDKP抗矽肺纖維化的作用相關。
【學位授予單位】：河北聯合大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R563.9
【圖文】：

標準曲線GAPDH

TGF-βⅠ和Ⅱ型受體mRNA的表達（Real-timePCR）

圖 3 溶解曲線（Real Time-PCR）TGF-β RⅠand GAPDH TGF-β RⅡand GAPDHMaker 1 2 3 4 555KD43KD72KD55KD43KD26KD43KD26KD55KD43KD130KDTGF-β RⅠ(55KD)TGF-β RⅡ(62KD)p-P38(43KD)P38(43KD)C-myc (49KD)Ⅰ型膠原(130 KD)

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 余維濤;崔社懷;楊雪梅;;特異性stealth siRNA抑制小鼠肺成纖維細胞TGF-β_1表達的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2007年21期

2 韓素莉;;胸腺嘧啶核苷摻入肺成纖維細胞作為檢測石棉生物活性的指標[J];國外醫(yī)學.衛(wèi)生學分冊;1983年05期

3 吳浩,許祖德,張月娥,張秀榮,張錦生,查錫良;纖維連接蛋白對大鼠肺成纖維細胞纖維連接蛋白和整合素α_5β_1表達的影響[J];上海醫(yī)科大學學報;2000年04期

4 陳曉玲!050017石家莊,陳祥銀,嚴儀昭,西品香;肺成纖維細胞增殖與其合成膠原功能間的關系[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2000年01期

5 宋明芬,彭開良,王

本文編號：2800107