發(fā)布時(shí)間：2020-08-16 19:59

【摘要】：目的 (1) 從小鼠肺組織里克隆mBD-6的cDNA。(2) 觀察肺組織中小鼠β-防御素-4、6的基因表達(dá)水平,探討mBD-4、6在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用。(3) 研究小鼠β-防御素4、6在乳鼠和成年鼠肺部的表達(dá)和調(diào)控情況。(4) 建立檢測hBD-3 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對(duì)肺癌患者的癌組織、正常肺組織進(jìn)行檢測,從mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析hBD-3基因在肺癌的表達(dá),以便用于進(jìn)行其與肺癌的關(guān)聯(lián)性的探討。 方法 (1) 提取大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射后小鼠肺組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,采用PCR的方法克隆小鼠β防御素-6基因。PCR產(chǎn)物連接入pGEM-EAST載體,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白篩選,對(duì)PCR鑒定含有目的片段的克隆進(jìn)行測序。(2) 將成年小鼠隨機(jī)分為兩組,一組為急性肺損傷組,一組為對(duì)照組。用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射復(fù)制急性肺損傷模型,于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,采用Trizol法提取肺組織總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量RCR檢測肺組織beta-防御素-4、6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平,測序鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。(3) 乳鼠與成年鼠各一組,用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射兩組小鼠,于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,采用Trizol法提取肺組織總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肺組織beta-防御素-4、6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。(4)應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光定量技術(shù),利用GAPDH作參照,建立檢測hBD-3 mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄FQ-PCR方法,并檢測13份正常肺組織和16份肺癌組織標(biāo)本hBD-3 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 (1) 獲得預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物,經(jīng)序列鑒定證實(shí)為小鼠β防御素-6基因。(2) 病理結(jié)果證實(shí)ALI動(dòng)物模型復(fù)制成功。對(duì)照組肺組織中各時(shí)間點(diǎn)及ALI組6h點(diǎn)均無β-防御素-4、6基因表達(dá)。而ALI組12h、1d、3d時(shí)表達(dá)顯著升高。(3) 小鼠β-防御素-4、6mRNA在LPS刺激12h后的幼鼠和成年鼠肺組織中均有表達(dá),熒光定量證實(shí)乳鼠LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織β-
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

克隆平板

oB卜6質(zhì)粒DNA的測序結(jié)果

mB卜4、6和p一aetin

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