【摘要】： 隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,在過(guò)去的20-30年間,變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis,AR)等變應(yīng)性疾病的發(fā)病率急劇上升,已成為全球性健康問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織(WHO)、世界過(guò)敏組織(WAO)在2005年將每年的7月8日確定為“世界過(guò)敏日”(WorldAllergy Day)。哮喘是AR最重要,最常見的并發(fā)癥,AR合并哮喘發(fā)生將嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量(quality of life,QOL)。文獻(xiàn)報(bào)道約1/3的變應(yīng)性鼻炎患者與支氣管哮喘常同時(shí)或先后出現(xiàn),部分患者先有鼻炎,數(shù)年后出現(xiàn)哮喘,部分患者鼻炎和哮喘基本同時(shí)出現(xiàn),部分患者先有哮喘,而后出現(xiàn)鼻炎,后者多見于兒童。近年來(lái)對(duì)AR與哮喘的發(fā)病機(jī)制中基因調(diào)控問(wèn)題的深入研究,使人們逐步認(rèn)識(shí)到AR合并哮喘的發(fā)生受到多種因素的調(diào)控,是多種生物分子和信號(hào)通路在時(shí)間和空間上復(fù)雜作用的結(jié)果,但傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測(cè)一個(gè)或幾個(gè)基因,不僅費(fèi)時(shí)、效率低,而且可比性亦較差。上世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的高通量的基因芯片技術(shù)可同時(shí)對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè),有效避免和彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的不足,結(jié)果客觀可信。其中的表達(dá)譜芯片是應(yīng)用最為廣泛的基因芯片�；诖�,本研究利用Affymetrix公司的人類全基因組芯片HU-U133-PLUS 2.0對(duì)SAR及SAR合并哮喘患者鼻黏膜行差異基因表達(dá)譜的研究,并將其作為研究變應(yīng)性鼻炎并發(fā)哮喘的基因調(diào)控機(jī)制的重要切入點(diǎn)。 研究分為兩部分,主要結(jié)果和內(nèi)容如下: 一基因芯片構(gòu)建及篩查變應(yīng)性鼻炎(AR)及其合并哮喘者的基因表達(dá)譜 1.選擇基因芯片待檢測(cè)標(biāo)本(AR及AR合并哮喘者下鼻甲黏膜)及標(biāo)本的總RNA提取、質(zhì)檢嚴(yán)格按照變應(yīng)性鼻炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1997年�？跁�(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn);支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用1997年制定的“支氣管哮喘防治指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn);選取臨床病例。同時(shí)RIZOL法提取SAR及SAR合并哮喘下鼻甲黏膜的總RNA,經(jīng)1.2%甲醛變性膠電泳鑒定RNA完整性,試劑盒純化RNA。結(jié)果表明入選臨床病例均符合相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)且為特應(yīng)性體質(zhì)。RNA甲醛電泳顯示28S、18S兩條rRNA條帶,且28S明顯亮于18S,OD260/OD280≥2.0,表明從下鼻甲黏膜標(biāo)本中成功提取RNA。 2.Affmetrix基因芯片技術(shù)研究變應(yīng)性鼻炎及其合并哮喘者的表達(dá)譜 將下鼻甲標(biāo)本的RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,再次轉(zhuǎn)錄為cRNA并以生物素標(biāo)記和片段化,與預(yù)制的Affymetrix人基因組U133Plus2.0(GeneChip Human U133Plus2.0)基因芯片雜交、并進(jìn)行芯片掃描和分析,部分差異基因用實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在所有檢測(cè)54675個(gè)探針(47,000個(gè)轉(zhuǎn)錄本)中,SAR標(biāo)本檢測(cè)到24924個(gè)轉(zhuǎn)錄本,表達(dá)基因檢出率為45.2%,SAR合并哮喘標(biāo)本檢測(cè)到22002個(gè)轉(zhuǎn)錄本,表達(dá)基因檢出率為40.2%,兩張芯片表達(dá)基因檢出率均在40%～50%之間,在哺乳動(dòng)物中,一般認(rèn)為在正常的細(xì)胞活動(dòng)中,只有不到50%的基因是表達(dá)的(Genome Res,2005,15:443-450)。對(duì)于全基因組規(guī)模的表達(dá)譜基因芯片,一般能檢測(cè)到40—50%基因是有表達(dá)的,表明芯片檢測(cè)的靈敏度很高。Signal Log Ratio欄中的值≥1或≤-1,代表信號(hào)強(qiáng)度之間的差異至少2倍。本研究設(shè)定差異至少2倍以上有意義,可得差異表達(dá)的基因共有1900個(gè),其中有849個(gè)基因,表達(dá)上調(diào),1051個(gè)表達(dá)下調(diào)。 二對(duì)SAR極其SAR合并哮喘者差異基因行分子生物信息學(xué)分析 3.SAR及其合并哮喘者差異基因的GO功能分類和生物通路(pathway)分析 利用GeneSpring軟件,依據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)AR及其合并哮喘者的2倍以上、4倍以上差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類;依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、GenMapp數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)2倍以上差異基因及差異最顯著的前十個(gè)基因行生物通路pathway分析。結(jié)果顯示2倍以上差異基因基因主要與細(xì)胞代謝、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、多種酶活性、膜受體結(jié)合活性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白活性等相關(guān);根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)2倍以上的基因分析其生物通路(pathway)分析得到:1900個(gè)基因分成161類,其中,包含20個(gè)以上基因的種類有:參與細(xì)胞因子受體間相互作用基因有40個(gè)、局部黏附基因28個(gè),細(xì)胞黏附分子26個(gè),參與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)的基因26個(gè),參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞基因24個(gè),縫隙連接相關(guān)基因23個(gè),參與促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路基因23個(gè),鈣相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路23個(gè),白細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因21個(gè),參與嘌呤代謝基因20個(gè)。在所有pathway中,最為引人的是炎癥反應(yīng)途徑(Hs_Inflammatory_Response_Pathway);在對(duì)上調(diào)、下降表達(dá)差異最大的十個(gè)基因分析得出:兩下調(diào)基因TEKT1(SLR=-7.2,即130多倍)、AKAP14(SLR=-6.7,即100多倍)均與鼻黏膜纖毛活性、運(yùn)動(dòng)相關(guān);RAF1參與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK signaling pathway)信號(hào)傳導(dǎo)通路。 4.鼻黏膜SCCA1、SCCA2表達(dá)水平有望成為變應(yīng)性鼻炎并發(fā)哮喘的相關(guān)生物標(biāo)記 對(duì)差異表達(dá)基因結(jié)合GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)、pubmed-NLM文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘(datamining)。結(jié)果顯示在GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中查到與哮喘相關(guān)基因354個(gè),變應(yīng)性鼻炎相關(guān)基因45個(gè),變應(yīng)性哮喘(allergic asthma)相關(guān)基因13個(gè),結(jié)合芯片差異表達(dá)基因和pubmed-NLM文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)示鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原SCCA1(SERPINB3)、SCCA2(SERPINB4)表達(dá)升高與SAR并發(fā)哮喘相關(guān)。 以上研究結(jié)果表明SAR合并哮喘的發(fā)生和發(fā)展,存在多基因表達(dá)調(diào)控的改變,對(duì)其差異基因表達(dá)譜的研究有助于闡明變應(yīng)性鼻炎合并哮喘的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,并有利于發(fā)現(xiàn)一些未知的與新基因功能潛在相關(guān)的信號(hào)通路,另外對(duì)成人SAR和SAR合并哮喘者的差異基因表達(dá)譜的構(gòu)建以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的逐漸明晰,為成人SAR與SAR合并哮喘基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)和AR相關(guān)疾病基因網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的建立提供了重要的數(shù)據(jù)。 評(píng)估基因芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性及其價(jià)值,除了從靶樣品的質(zhì)量與數(shù)量、芯片檢測(cè)與驗(yàn)證技術(shù)、數(shù)據(jù)挖掘策略與方法三個(gè)方面來(lái)考察,還應(yīng)充分考慮基因表達(dá)的選擇性、時(shí)空性和非最終性。因?yàn)?mRNA的表達(dá)水平并不完全等同于蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(蛋白質(zhì)表達(dá)水平也只是代表蛋白質(zhì)的存在及其量的差異),基因表達(dá)的最終結(jié)果要看其編碼的蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)�？傊�,對(duì)mRNA水平的表達(dá)差異應(yīng)有全面、合理、客觀的認(rèn)識(shí)和解釋。本研究的一些結(jié)果還需大樣本、多水平的臨床驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R765.21;R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2792321