【摘要】：背景和目的: 急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是臨床常見的呼吸系統(tǒng)急危重癥之一,感染是該病的主要誘因,革蘭氏陰性桿菌感染致ALI,主要是由于內(nèi)毒素(Endotoxin)的主要成分脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)活化炎性細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子所致。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AMs)是呼吸道的重要防線,亦是LPS的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究其LPS致傷作用的信號通路及阻斷效應(yīng),對幫助了解ALI的發(fā)生機(jī)制,尋找ALI治療的新靶位,具有重要的理論和實(shí)際意義。 核仁素是一種穿梭蛋白,它可以自由穿梭于細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞膜之間,它參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),并在病原微生物的感染和自身免疫系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮一定的作用。核仁素可以幫助病原微生物粘附于宿主細(xì)胞并進(jìn)入宿主細(xì)胞,這使核仁素成為抗微生物感染的新的治療靶點(diǎn)。目前,有研究報(bào)道,在外周血的單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞膜表面也有核仁素表達(dá)和分布,并參與了LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放,其具體的信號傳導(dǎo)途徑尚未闡明。AMs是來源于外周血的單核細(xì)胞,核仁素在其細(xì)胞膜表面是否有表達(dá),以及是否參與了LPS對AMs的激活尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 本研究旨在通過檢測大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面核仁素的表達(dá)分布變化,觀察膜核仁素與LPS的相互作用,探討膜核仁素在LPS激活A(yù)Ms中的作用,初步闡明其在LPS致急性肺損傷中的作用及機(jī)制。 方法: 1.檢測大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的表達(dá)采用支氣管肺泡灌洗法分離獲得大鼠肺泡巨噬細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光激光共聚焦法及流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面核仁素的表達(dá)。 2.觀察肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素與LPS相互作用應(yīng)用親和層析法,制備LPS的親和層析柱,分離純化與LPS結(jié)合的肺泡巨噬細(xì)胞膜結(jié)合蛋白。ELISA法檢測LPS與核仁素的結(jié)合反應(yīng)。采用雙重免疫熒光法,用FITC標(biāo)記的LPS以及Cy3標(biāo)記的核仁素抗體共同孵育肺泡巨噬細(xì)胞,觀察二者在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。流式細(xì)胞術(shù)分析核仁素抗體對肺泡巨噬細(xì)胞結(jié)合LPS的影響。 3.LPS誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素的基因和膜蛋白表達(dá)變化用RT-PCR和Western blot的方法分別檢測LPS誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白在不同時(shí)相點(diǎn)上的表達(dá)變化。用RT-PCR和Western blot法分別檢測不同濃度的LPS誘導(dǎo)下肺泡巨噬細(xì)胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表達(dá)變化。 4.體外轉(zhuǎn)染核仁素RNAi表達(dá)載體對LPS激活肺泡巨噬細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究分離、培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞,在LPS刺激前予以轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA。免疫熒光及激光共聚焦觀察LPS內(nèi)化入肺泡巨噬細(xì)胞情況。Western blot檢測膜核仁素蛋白表達(dá)。EMSA檢測肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB活性。ELISA檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6表達(dá)。 5.體內(nèi)轉(zhuǎn)染核仁素RNAi表達(dá)載體對LPS肺損傷大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活化的影響SD大鼠麻醉后行氣管插管,氣管內(nèi)滴入pBS-U6.C23shRNA,對照組滴入pBS-U6.controlshRNA,48h后予以尾靜脈注射LPS,復(fù)制急性肺損傷模型。取左下肺行HE染色。肺泡灌洗分離培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞,Western blot檢測肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素蛋白表達(dá);EMSA檢測肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB活性;ELISA檢測肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6表達(dá)。 結(jié)果 1.成功分離培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞,免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)均觀察到大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面有核仁素表達(dá)。 2.通過親和層析法分離純化得到LPS膜結(jié)合蛋白核仁素,膜核仁素可以與LPS直接結(jié)合,ELISA檢測顯示二者的結(jié)合反應(yīng)呈濃度依賴性增加。同時(shí),運(yùn)用雙重?zé)晒夤捕ㄎ环ㄓ^察到核仁素與LPS 1h后共定位于細(xì)胞膜上,4h后共定位于細(xì)胞漿內(nèi),流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)抗核仁素的抗體顯著抑制了LPS與肺泡巨噬細(xì)胞結(jié)合。 3.正常未受刺激的細(xì)胞即可見核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)。1ug/ml的LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞,1h后核仁素的mRNA表達(dá)開始升高,4h達(dá)到高峰,隨后逐漸減弱;膜核仁素的蛋白表達(dá)2h開始升高,8h達(dá)到高峰,12h后逐漸下降。用不同濃度的LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組核仁素的mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P0.01),而且隨著LPS濃度的增加,其表達(dá)呈濃度依賴性增強(qiáng),當(dāng)LPS濃度達(dá)到100ug/ml時(shí),繼續(xù)增加LPS的濃度,核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表達(dá)不再增加。 4.LPS刺激后的未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA對照組的細(xì)胞膜核仁素蛋白的表達(dá)、LPS的內(nèi)化、NF-κB的活性以及上清液中TNF-α和IL-6的含量均較未刺激細(xì)胞增強(qiáng)(P0.01) ;轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA組的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組相比,以上指標(biāo)均明顯降低(P0.01)。 5.氣道內(nèi)轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA或pBS-U6.controlshRNA 48h后,大鼠生長狀態(tài)良好。LPS肺損傷模型建立后行肺泡灌洗,與對照組相比,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組的肺病理損傷、肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的蛋白表達(dá)、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高(P0.01) ;轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA組肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素的蛋白表達(dá)明顯下調(diào),干擾效果達(dá)72%;肺病理損傷評分、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pBS-U6.controlshRNA組(P0.01)。 結(jié)論: 1.正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜表面表達(dá)有核仁素,LPS可以增強(qiáng)核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表達(dá)。 2.肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素可能是LPS的一種新的膜結(jié)合受體,它參與了LPS的內(nèi)化。 3.膜核仁素協(xié)助LPS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,可以激活核轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放,膜核仁素參與了LPS致傷作用的信號傳導(dǎo)。 4.氣管內(nèi)滴入法可以安全有效轉(zhuǎn)染pBS-U6.C23shRNA,降低肺泡巨噬細(xì)胞膜核仁素蛋白表達(dá),減弱核因子活性,減少TNF-α和IL-6的生成,減輕肺損傷。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R563.8
【圖文】：

PBS 洗滌 2 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清。加入 FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育 30 分鐘。PBS 洗 1 次，1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清。加 300μl PBS，上機(jī)行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié) 果大鼠肺泡巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察胞懸液接種于培養(yǎng)板 30 min 后肺泡巨噬細(xì)胞呈圓形、透亮（圖 1-1-1觀察到呈橢圓形、三角形或不規(guī)則形的貼壁細(xì)胞，胞質(zhì)豐富；24h 后細(xì)，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形、星形、不規(guī)則形、梭形等形態(tài)，有許多偽，胞質(zhì)豐富(圖 1-1-1B)。

-2大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24h行瑞-姬氏染色(×200)

圖 1-1-4 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的電鏡觀察(×800測：h 墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)，在 400 倍光鏡下觀察,隨數(shù)胞漿中吞有大小墨粒 5 個(gè)以上的陽性質(zhì)及偽足和突起均有密集的墨汁顆粒，顯-1-5。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 呂昕;極低頻電磁場下脾臟淋巴細(xì)胞的變化[D];沈陽工業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2783869