【摘要】： 急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的常見并發(fā)癥，其確切發(fā)病機制尚不明確。SAP發(fā)病1周內死亡的患者，60％死于ALI／ARDS或伴有ALI／ARDS的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，防治肺損傷成為降低SAP死亡率的重要措施。促炎因子拮抗劑或抑炎因子協(xié)同劑的作用是近年來急性胰腺炎并發(fā)肺損傷防治研究的熱點。大量動物實驗表明促炎因子拮抗劑或抑炎因子協(xié)同劑對急性胰腺炎相關性肺損傷(acute pancreatitis-associated acute lung injury，APALI)防治效果明顯，但遺憾的是，對于人來說，幾乎沒有明顯的臨床療效。其原因可能與復雜的炎性因子網(wǎng)絡相互作用有關，單一的促炎因子拮抗劑或抑炎因子協(xié)同劑的應用，可能導致炎性因子的失衡進一步加重；而且這些藥物的藥代動力學和毒性效應也限制了這些藥物在伴有MODS的重癥患者中的應用。再者，試驗大多靶向于發(fā)病早期的一些炎癥介質，而事實上，往往對患者進行干預治療時，可能全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的整個級聯(lián)反應已經(jīng)啟動。而近來在內毒素血癥和膿毒癥中研究頗多且療效明顯的丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)在急性胰腺炎及其器官功能損傷的可能作用尚未引起足夠的重視。 近來研究表明丙酮酸乙酯是一種抗氧化劑和活性氧清除劑，并可調節(jié)多種炎癥介質的釋放，包括早期和晚期炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)等，且無細胞毒性。 基于對以上研究現(xiàn)狀的認識，本研究擬通過建立簡便、易復制、重復性好的急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)并發(fā)急性肺損傷動物模型，探討急性壞死性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機制；觀察丙酮酸乙酯延遲應用是否可減輕急性壞死性胰腺炎肺損傷及可能作用機制；并研究大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1的表達在急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用及意義。 方法 1、實驗動物模型的建立及取材：健康雄性Wistar大鼠72只，體重220～250g，隨機分為三組：假手術組(SO)、ANP組及EP治療組。ANP組及EP治療組大鼠予逆行性胰膽管注射5％�；悄懰徕c制作ANP模型，假手術組大鼠僅開腹并翻動十二指腸數(shù)次；EP治療組于制模后經(jīng)尾靜脈或股靜脈延遲給予EP溶液(EP溶于乳酸鈉林格液中，28mM)，每次劑量為40mg／kg。各組大鼠分別于制模后6h、12h及24h取材。 2、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清TNF-α和IL-6水平； 3、比色法檢測肺組織的髓過氧化物酶(MPO)水平、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活力； 4、半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測肺組織HMGB1 mRNA表達：用經(jīng)典的Trizol法進行肺組織RNA提取，定量后以其為模板逆轉錄合成cDNA第一鏈，然后用HMGB1引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測； 5、生化法檢測血清淀粉酶、血氧變化及觀察胰腺、肺組織大體及光鏡下的病理變化。 結果 1、隨著制模時間的延長，ANP組大鼠血清淀粉酶逐漸升高，腹水量逐漸增加，各時相點動物的胰腺組織均存在不同程度的間質水腫、炎細胞浸潤、灶性或片狀出血壞死，胰腺及周圍組織出現(xiàn)脂肪壞死及皂化斑，并伴血性腹水，呈典型的ANP病理改變；同時肺組織在各時相點形態(tài)上出現(xiàn)了不同程度的炎細胞浸潤及肺間質、肺泡水腫、出血、灶性或大片肺不張等典型的ALI病理改變；在功能方面，PaO_2進行性下降； 2、ANP組大鼠肺組織的髓過氧化物酶(MPO)活性隨著制模時間的延長而升高，EP治療組與ANP組相比較，肺組織MPO水平均較低，且各時點均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05) 3、ANP組血清TNF-α和IL-6水平在制模后6h達高峰，12h下降，在此兩時點治療組血清TNF-α和IL-6水平明顯低于ANP組(P＜0.05)； 4、ANP組肺組織HMGB1 mRNA表達水平在制模后12h明顯升高，至24h仍維持在高水平，治療組肺組織HMGB1 mRNA表達水平在制模后12、24h明顯低于ANP組(P＜0.05)； 5、ANP組大鼠肺組織的丙二醛(MDA)水平隨著制模時間的延長而升高，而SOD活力則逐漸降低：EP治療組與ANP組相比較，肺組織MDA水平均較低，且在6h及12h組有統(tǒng)計學差異，SOD活力則均高于ANP組，且各時點均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 6、同期胰腺、肺病理改變治療組比ANP組明顯減輕，且PaO_2均明顯高于ANP組。 結論 1、逆行性膽胰管注射�；悄懰徕c誘導ANP并發(fā)ALI的大鼠模型是成功的，本模型操作方法簡單，重復性好。本模型之ANP早期就合并急性肺損傷，表現(xiàn)為肺組織的炎癥浸潤并有功能障礙。 2、�；悄懰徕c誘導ANP發(fā)生后，可能通過活性胰酶的釋放和中性粒細胞、單核巨噬細胞的激活，釋放大量損害性炎性介質包括細胞因子如丁NF-α、IL-6等，通過炎癥介質作用導致中性粒細胞等炎癥細胞在肺部浸潤、聚集活化，釋放多種損傷因子如多種促炎細胞因子(TNF-α、HMGB1等)及氧自由基等有害物質直接作用于肺組織而致?lián)p傷。 3、�；悄懰徕c誘導ANP發(fā)生后，肺組織HMGB1表達增高較晚且持續(xù)時間長，因而可能成為ANPALI防治切實可行的潛在干預目標，能給ANPALI提供更廣的治療窗。 4、丙酮酸乙酯具有抗氧化作用，且能明顯抑制ANP肺損傷大鼠早期和晚期促炎細胞因子的釋放和表達(TNF-α、IL-6、HMGB1)，減輕肺組織病理損傷程度。與其他專門調控單一細胞因子的重組蛋白相比，丙酮酸乙酯在ANP肺損傷發(fā)病后有較長的“治療窗”。丙酮酸乙酯對ANP肺損傷的防治具有良好應用前景。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R657.51;R563.8
【圖文】：

ANP組和EP治療組的血清淀粉酶水平隨制模后時間的延長而增高。同一時間點的血清淀粉酶水平，ANP組和EP治療組均明顯高于假手術組;而EP治療組均較ANP組低，且在6h及12h有統(tǒng)計學差異(見表2一1及圖1)。表2一1，各組動物血清淀粉酶檢測值(U/L，x士s)n=8血清淀粉酶檢測值組別— 6h1Zh24h假手術組1115士 166116升 1881199士233ANP組3240士432△3743士528△4044士394△EP治療組2799士334△ *3115士429△*3657士365△注:△與假手術組比較 p<0.05;*與ANP組比較p<0.05。 5555555555555000...................................假手術組 000................一 一血血清淀粉酶 3000...口....仗....一.1竺男，二，’也 }組口口口EP治療組0......._....}竺二竺!蘭二 _}}} 1111111111111000...............一 一 000一 一 666h12h24hhh時 時間 間圖1，血清淀粉酶檢測值2、動脈血氧分壓測定結果:ANP組和EP治療組的動脈血氧分壓隨制模后時間的延長而降低。同一時間點的血氧分壓水平，ANP組和EP治療組均明顯低于假手術組;而EP治療組均較ANP組為高，且在12h及24h有統(tǒng)計學差異(見表2一2及圖2)。

ANP組和EP治療組的動脈血氧分壓隨制模后時間的延長而降低。同一時間點的血氧分壓水平，ANP組和EP治療組均明顯低于假手術組;而EP治療組均較ANP組為高，且在12h及24h有統(tǒng)計學差異(見表2一2及圖2)。

同一時間點的血清TNF一a和IL一6水平，ANP組和EP治療組均明顯高于假手術組，且二者血清值在6h組即達到高峰;而EP治療組均較ANP組為低，且在6h、12h組有統(tǒng)計學差異(見表2一3、表2一4及圖3、4)表2一3，各組動物血清TNF一a檢測結果(n幼，x士s)n=8組別血清TNF一a檢測值12h24h假手術組ANP組EP治療組55.7土17.337.7士12.2196.3士16.3△131.6士29.6△*90.2士20.1△65.0士16.6△*28.5士 11.882.升28.8△60.5士18.3△注:△與假手術組比較尸<0.05;*與ANP組比較 p<0.05。

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