【摘要】： 背景與目的: 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺損傷(SW-ALI),進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致海水型急性呼吸窘迫綜合征(SW-ARDS),病情兇險(xiǎn),死亡率高。由于炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),人們將對(duì)ALI的研究轉(zhuǎn)向炎癥調(diào)控機(jī)制的研究,以期控制炎癥反應(yīng),減輕損傷,從而降低ALI的發(fā)病率和死亡率。蛋白酶激活受體-2(PAR2)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族,激活后可參與炎癥反應(yīng),但在肺部炎癥反應(yīng)中的致病作用還存在爭(zhēng)議,在SW-AIL中的作用尚未提及,且PAR2激活后下游信號(hào)通路仍不清楚,有待進(jìn)一步探討。FUT-175作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,可抑制PAR2的激活,減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放,但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及,有待進(jìn)一步研究。為此,本課題擬從細(xì)胞水平檢測(cè)海水對(duì)A549細(xì)胞PAR2表達(dá)的影響,從分子水平探討PAR2激活后的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及FUT-175和PAR2抗體對(duì)其下游信號(hào)通路的干預(yù)作用,從器官水平觀察FUT-175對(duì)SW-ALI大鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺微血管通透性的影響,旨在明確PAR2在SW-ALI中的作用及機(jī)制,從抗炎的角度揭示FUT-175對(duì)SW-ALI大鼠的保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用FUT-175治療SW-ALI提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.將培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、海水干預(yù)2、4、8、16h組,各組細(xì)胞干預(yù)相應(yīng)的時(shí)間后進(jìn)行指標(biāo)觀測(cè)。收集上清檢測(cè)TNF-α和IL-8濃度,收集細(xì)胞用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot法檢測(cè)PAR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。 2.將培養(yǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組(control組)、海水干預(yù)組(seawater組)、海水+PAR2抗體組(PAR2-antibody組)、海水+FUT-175組(FUT-175組)、海水+SB203580組(SB203580組)、海水+PD98059組(PD98059組)、海水+SP600125組(SP600125組)。對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)液,海水組加入海水培養(yǎng)8h;PAR2-antibody組用PAR2單克隆抗體2mg/L預(yù)處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;FUT-175組用FUT-175 10μM預(yù)處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;SB203580組用SB203580 10μM預(yù)處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;PD98059組用PD98059 10μM預(yù)處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;SP600125組用SP600125 0μM預(yù)處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h。control組、seawater組、PAR2-antibody組和FUT-175組收集細(xì)胞用Western印跡法和EMSA法分別檢測(cè)磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)量、磷酸化ERK蛋白表達(dá)量、磷酸化JNK蛋白表達(dá)量和NF-κB活化水平;各組細(xì)胞收集上清檢測(cè)TNF-α和IL-8濃度。 3.采用海水吸入法復(fù)制大鼠ALI模型,吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALI模型。將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、海水吸入2、4、8h組,取肺組織用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PAR2 mRNA表達(dá)水平,用Western blot法和免疫組化法檢測(cè)PAR2蛋白表達(dá)情況。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法復(fù)制大鼠ALI模型,96只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、海水組(seawater組)、LPS組(LPS組)和FUT-175治療海水吸入組(FUT-175組)。海水組和LPS組分別吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALI模型。seawater組:模型復(fù)制成功后20min,經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水2ml/kg。FUT-175組:海水型ALI模型復(fù)制成功后20min,經(jīng)尾靜脈注射FUT-175 10mg/kg。4組大鼠觀察8小時(shí),分別于模型建立及干預(yù)后0.5、1、2、4、8h進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?最后檢測(cè)肺微血管通透性(PMVP)、肺濕/干重比(W/D)、肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)、血漿IL-8和TNF-α水平,并觀察病理學(xué)變化。 結(jié)果: 1.與正常對(duì)照組比較,海水處理后,A549細(xì)胞PAR2 mRNA在4h時(shí)顯著升高(P0.05),隨著時(shí)間延長(zhǎng),在8h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的1.8倍),此后一直顯著高于對(duì)照組(P0.01)。A549細(xì)胞PAR2蛋白表達(dá)量也在4h時(shí)顯著升高(P0.05),在8h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的2.2倍),此后一直顯著高于對(duì)照組(P0.01)。A549細(xì)胞經(jīng)海水處理后,上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高,2 h達(dá)最高峰,顯著高于對(duì)照組(P0.01)。此后有所下降,但在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P0.01)。 2.與正常對(duì)照組比較,海水處理后,A549細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平顯著升高(分別為對(duì)照組的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P0.01-0.05),NF-κB活化水平顯著升高(為對(duì)照組的6.7倍)(P0.01),而FUT-175和PAR2抗體預(yù)處理組同海水處理組比較,A549細(xì)胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB活化水平顯著降低(P0.01-0.05)。海水處理后,A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α顯著升高(P0.01),而FUT-175、PAR2抗體、SB203580、PD98059和SP600125預(yù)處理組同海水處理組比較,上清液中IL-8和TNF-α則顯著降低(P0.01)。 3.與正常對(duì)照組比較,海水吸入后,大鼠肺組織PAR2 mRNA和蛋白表達(dá)量在2h時(shí)即顯著升高(P0.05),隨著時(shí)間延長(zhǎng),在4h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的2.8倍),此后均顯著高于對(duì)照組(P0.01)。同時(shí)大鼠肺組織PAR2蛋白表達(dá)量在2h時(shí)即顯著升高(P0.05),隨著時(shí)間延長(zhǎng),在4h點(diǎn)達(dá)最高峰(為對(duì)照組的4.2倍),此后均顯著高于對(duì)照組(P0.01)。PAR2免疫組化顯示,在正常對(duì)照組,PAR2微弱表達(dá)于肺泡、支氣管上皮和肺泡巨噬細(xì)胞,海水吸入2h后,陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng),不僅見(jiàn)于肺泡和支氣管上皮細(xì)胞,還見(jiàn)于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞。 4.與正常對(duì)照組比較,海水和LPS吸入致傷組大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺組織MPO活性增高、血漿IL-8和TNF-α升高、肺組織病理形態(tài)學(xué)積分增加(P0.01);海水組PaO2明顯低于LPS組,而MPO、W/D和PVMP明顯高于LPS組(P0.01)。FUT-175治療海水吸入組上述指標(biāo)均顯著改善(P0.01-0.05)。 結(jié)論: 1.海水處理A549細(xì)胞,可上調(diào)A549細(xì)胞PAR2的表達(dá),導(dǎo)致IL-8和TNF-α釋放的增加,同時(shí)可導(dǎo)致A549細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。 2.海水激活A(yù)549細(xì)胞PAR2后,通過(guò)MAPK信號(hào)通路和NF-B信號(hào)通路,導(dǎo)致IL-8和TNF-α釋放增加,是海水處理A549細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。 3.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175和PAR2抗體可通過(guò)抑制PAR2的激活,對(duì)海水處理的A549具有保護(hù)作用。 4.海水吸入后大鼠肺組織PAR2表達(dá)上調(diào),在海水所致急性肺損傷中起重要作用。 5.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175對(duì)海水吸入所致急性肺損傷大鼠具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制肺組織PAR2的激活,阻斷其下游的炎癥反應(yīng),減輕肺損傷,降低肺血管通透性,減輕肺水腫。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R649.3;R563.8

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本文編號(hào)：2782730