【摘要】： 實驗目的 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)存在發(fā)病率和病死率高的特點,目前臨床各種治療手段尚未能使其病死率明顯下降,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導炎癥性肺損傷為研究對象,探討炎癥性肺損傷新的治療措施及缺氧誘導有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)這一肺損傷過程中新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子的作用。由于HIMF旁分泌和自分泌作用于局部肺組織,本課題以骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)作為載體攜帶HIMF進入肺損傷局部,在除外HIMF旁分泌和自分泌作用的影響下觀察單純MSC和MSC聯(lián)合HIMF在炎癥損傷的不同階段對疾病發(fā)展的影響和可能的作用。 實驗方法 采用經(jīng)典的全骨髓分離法從Balb/c小鼠中分離MSC進行原代培養(yǎng)、傳代及性質鑒定。在確定分離的MSC為目的細胞后,與小鼠肺上皮細胞(MLE12)在炎癥微環(huán)境中體外共培養(yǎng),觀察對MSC功能的影響;另一方面包裝含目的基因HIMF的慢病毒過表達載體,轉導MSC確定轉導效率、轉導最佳MOI值、轉導時間等。在LPS誘導小鼠肺炎癥性損傷的動物實驗中,分為三組包括單純生理鹽水組、MSC組、MSC-HIMF組進行研究。觀察不同時間點不同干預組中反映炎癥損傷各指標(W/D、MPO、肺組織和BALF中炎癥因子TNF-α和抗炎因子IL-10表達、BALF總蛋白水平)的變化和肺泡上皮細胞凋亡水平的變化,探討MSC和HIMF在炎癥性肺損傷中的作用。 實驗結果 1.全骨髓貼壁法可以成功獲得高純度的MSC,并經(jīng)流式細胞儀檢測、多胚層分化實驗得以驗證和確認。 2.體外共培養(yǎng)炎癥條件下MSC表達抗炎因子明顯增加,具有免疫調節(jié)作用。 3.炎癥條件下MSC細胞周期并沒有發(fā)生顯著變化,仍以G0/G1期細胞為主。 4.Lentivirus系統(tǒng)可以成功轉導目的基因HIMF至MSC,并穩(wěn)定表達HIMF。實驗確定最佳MOI值為5(poly=5ug/ml),最佳體內植入時間為轉導后第5天。GFP作為體內示蹤劑操作簡便且易于觀察。 5.肺組織病理評分:MSCs治療組的肺損傷程度較對照組明顯減輕,差異有統(tǒng)計學意義;MSC-HIMF治療組急性期肺損傷程度并沒有減輕,并且較對照組相比,炎癥持續(xù)存在,有慢性化趨勢,部分肺組織存在膠原沉積增加。 6.肺炎癥損傷指標:較對照組相比,MSC干預組表現(xiàn)為W/D降低、MPO活性下降、肺內和肺泡灌洗液中炎癥因子含量的降低和抗炎因子表達的明顯增加,提示MSC干預可明顯減輕肺內的急性炎癥反應;而MSC-HIMF組在治療過程中W/D比值增加、MPO活性增強、肺內和肺泡灌洗液中炎癥因子含量升高,并且維持到d14天,肺泡灌洗液中總蛋白含量明顯增加。提示HIMF可促進肺內炎癥反應,且炎癥損傷持續(xù)存在。 7.MSC減輕肺炎癥損傷的機制:MSC治療組肺組織和BALF中均出現(xiàn)明顯的炎癥因子含量的降低和抗炎因子表達的明顯增加,推測MSC在炎癥性肺損傷中發(fā)揮保護作用的可能原因之一是其調節(jié)了肺組織局部的免疫狀態(tài),當然在急性期MSC可以與肺部受損細胞融合或轉化發(fā)揮治療作用。 結論 1.MSC可成功體外分離純化、維持細胞功能,慢病毒轉導MSC可作為一種可行的攜帶外源基因的方法。 2.MSC干預LPS誘導的炎癥損傷可明顯減輕肺內的急性炎癥反應,可能機制之一為調節(jié)肺組織局部的免疫狀態(tài)。 3.HIMF可促進肺內的炎癥反應,且炎癥反應呈現(xiàn)慢性化趨勢。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8
【圖文】：

圖1.1Transwen共培養(yǎng)體系示意圖實驗步驟:1.先將MSC以一定的密度(l.5*10s/孔)接種至Transwe小時MSC貼壁良好，可生長至70一80%左右。2.另一方面將MLE一12以一定的密度(3*10乍孔)接種層，5一6小時細胞貼壁生長良好后，將MLE12細胞移至培養(yǎng)，換用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并加入一定濃度的3.10小時后收集上清進行炎癥與抗炎因子檢測，收集包括MSC炎癥因子TNF一Q、IL一6與抗炎因子IL一10基因養(yǎng)對MSC周期的影響。

圖1.2P3代MSC，形態(tài)較為均一(x200)二、璐C培養(yǎng)基的選擇和CFUeeF側定本實驗研究顯示對于5一6周齡的Balb/c小鼠，單純DMEMesLG培養(yǎng)基原代培養(yǎng)的MSCs克隆集落較大且集落數(shù)量較多，CFU一F為2.71/106個骨艘細胞:I初M培養(yǎng)基的克隆集落較小，CFU一為2.13/106個骨艘細胞:而D班】/F12培養(yǎng)基的MSCs克隆集落大并且數(shù)量多，細胞形態(tài)較好，CFU一F為4.9/106個骨髓細胞;Q挽M培養(yǎng)基的挑Cs呈彌漫分布，克隆集落較多，CFU一F為4.5/106個骨健細胞。經(jīng)以適當?shù)拿芏葌鞔�，DME腳F12和。挑M培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs在細胞密度依賴性的情況下細胞生長形態(tài)及活力優(yōu)于DMI繃一LG和IMDM培養(yǎng)基，故本實驗選用QMEM培養(yǎng)基進行后續(xù)實驗研究。

圖1.2P3代MSC，形態(tài)較為均一(x200)、璐C培養(yǎng)基的選擇和CFUeeF側定本實驗研究顯示對于5一6周齡的Balb/c小鼠，單純DMEMesLG培養(yǎng)基s克隆集落較大且集落數(shù)量較多，CFU一F為2.71/106個骨艘細胞:克隆集落較小，CFU一為2.13/106個骨艘細胞:而D班】/F12培養(yǎng)基大并且數(shù)量多，細胞形態(tài)較好，CFU一F為4.9/106個骨髓細胞;QCs呈彌漫分布，克隆集落較多，CFU一F為4.5/106個骨健細胞。經(jīng)代后，DME腳F12和。挑M培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs在細胞密度依賴性的長形態(tài)及活力優(yōu)于DMI繃一LG和IMDM培養(yǎng)基，故本實驗選用QMEM培養(yǎng)研究。

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 秦小惠;移植骨髓間充質干細胞對乳腺炎模型大鼠乳腺作用的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2013年

本文編號：2779311