發(fā)布時(shí)間：2020-08-03 07:32

【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?急性肺損傷(acute lung injury,ALI)存在發(fā)病率和病死率高的特點(diǎn),目前臨床各種治療手段尚未能使其病死率明顯下降,本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)炎癥性肺損傷為研究對(duì)象,探討炎癥性肺損傷新的治療措施及缺氧誘導(dǎo)有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)這一肺損傷過(guò)程中新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子的作用。由于HIMF旁分泌和自分泌作用于局部肺組織,本課題以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)作為載體攜帶HIMF進(jìn)入肺損傷局部,在除外HIMF旁分泌和自分泌作用的影響下觀察單純MSC和MSC聯(lián)合HIMF在炎癥損傷的不同階段對(duì)疾病發(fā)展的影響和可能的作用。 實(shí)驗(yàn)方法 采用經(jīng)典的全骨髓分離法從Balb/c小鼠中分離MSC進(jìn)行原代培養(yǎng)、傳代及性質(zhì)鑒定。在確定分離的MSC為目的細(xì)胞后,與小鼠肺上皮細(xì)胞(MLE12)在炎癥微環(huán)境中體外共培養(yǎng),觀察對(duì)MSC功能的影響;另一方面包裝含目的基因HIMF的慢病毒過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、轉(zhuǎn)導(dǎo)最佳MOI值、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間等。在LPS誘導(dǎo)小鼠肺炎癥性損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,分為三組包括單純生理鹽水組、MSC組、MSC-HIMF組進(jìn)行研究。觀察不同時(shí)間點(diǎn)不同干預(yù)組中反映炎癥損傷各指標(biāo)(W/D、MPO、肺組織和BALF中炎癥因子TNF-α和抗炎因子IL-10表達(dá)、BALF總蛋白水平)的變化和肺泡上皮細(xì)胞凋亡水平的變化,探討MSC和HIMF在炎癥性肺損傷中的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.全骨髓貼壁法可以成功獲得高純度的MSC,并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)、多胚層分化實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證和確認(rèn)。 2.體外共培養(yǎng)炎癥條件下MSC表達(dá)抗炎因子明顯增加,具有免疫調(diào)節(jié)作用。 3.炎癥條件下MSC細(xì)胞周期并沒(méi)有發(fā)生顯著變化,仍以G0/G1期細(xì)胞為主。 4.Lentivirus系統(tǒng)可以成功轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因HIMF至MSC,并穩(wěn)定表達(dá)HIMF。實(shí)驗(yàn)確定最佳MOI值為5(poly=5ug/ml),最佳體內(nèi)植入時(shí)間為轉(zhuǎn)導(dǎo)后第5天。GFP作為體內(nèi)示蹤劑操作簡(jiǎn)便且易于觀察。 5.肺組織病理評(píng)分:MSCs治療組的肺損傷程度較對(duì)照組明顯減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;MSC-HIMF治療組急性期肺損傷程度并沒(méi)有減輕,并且較對(duì)照組相比,炎癥持續(xù)存在,有慢性化趨勢(shì),部分肺組織存在膠原沉積增加。 6.肺炎癥損傷指標(biāo):較對(duì)照組相比,MSC干預(yù)組表現(xiàn)為W/D降低、MPO活性下降、肺內(nèi)和肺泡灌洗液中炎癥因子含量的降低和抗炎因子表達(dá)的明顯增加,提示MSC干預(yù)可明顯減輕肺內(nèi)的急性炎癥反應(yīng);而MSC-HIMF組在治療過(guò)程中W/D比值增加、MPO活性增強(qiáng)、肺內(nèi)和肺泡灌洗液中炎癥因子含量升高,并且維持到d14天,肺泡灌洗液中總蛋白含量明顯增加。提示HIMF可促進(jìn)肺內(nèi)炎癥反應(yīng),且炎癥損傷持續(xù)存在。 7.MSC減輕肺炎癥損傷的機(jī)制:MSC治療組肺組織和BALF中均出現(xiàn)明顯的炎癥因子含量的降低和抗炎因子表達(dá)的明顯增加,推測(cè)MSC在炎癥性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用的可能原因之一是其調(diào)節(jié)了肺組織局部的免疫狀態(tài),當(dāng)然在急性期MSC可以與肺部受損細(xì)胞融合或轉(zhuǎn)化發(fā)揮治療作用。 結(jié)論 1.MSC可成功體外分離純化、維持細(xì)胞功能,慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC可作為一種可行的攜帶外源基因的方法。 2.MSC干預(yù)LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷可明顯減輕肺內(nèi)的急性炎癥反應(yīng),可能機(jī)制之一為調(diào)節(jié)肺組織局部的免疫狀態(tài)。 3.HIMF可促進(jìn)肺內(nèi)的炎癥反應(yīng),且炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)慢性化趨勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8
【圖文】：

圖1.1Transwen共培養(yǎng)體系示意圖實(shí)驗(yàn)步驟:1.先將MSC以一定的密度(l.5*10s/孔)接種至Transwe小時(shí)MSC貼壁良好，可生長(zhǎng)至70一80%左右。2.另一方面將MLE一12以一定的密度(3*10乍孔)接種層，5一6小時(shí)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，將MLE12細(xì)胞移至培養(yǎng)，換用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入一定濃度的3.10小時(shí)后收集上清進(jìn)行炎癥與抗炎因子檢測(cè)，收集包括MSC炎癥因子TNF一Q、IL一6與抗炎因子IL一10基因養(yǎng)對(duì)MSC周期的影響。

圖1.2P3代MSC，形態(tài)較為均一(x200)二、璐C培養(yǎng)基的選擇和CFUeeF側(cè)定本實(shí)驗(yàn)研究顯示對(duì)于5一6周齡的Balb/c小鼠，單純DMEMesLG培養(yǎng)基原代培養(yǎng)的MSCs克隆集落較大且集落數(shù)量較多，CFU一F為2.71/106個(gè)骨艘細(xì)胞:I初M培養(yǎng)基的克隆集落較小，CFU一為2.13/106個(gè)骨艘細(xì)胞:而D班】/F12培養(yǎng)基的MSCs克隆集落大并且數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)較好，CFU一F為4.9/106個(gè)骨髓細(xì)胞;Q挽M培養(yǎng)基的挑Cs呈彌漫分布，克隆集落較多，CFU一F為4.5/106個(gè)骨健細(xì)胞。經(jīng)以適當(dāng)?shù)拿芏葌鞔�，DME腳F12和。挑M培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs在細(xì)胞密度依賴性的情況下細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及活力優(yōu)于DMI繃一LG和IMDM培養(yǎng)基，故本實(shí)驗(yàn)選用QMEM培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1.2P3代MSC，形態(tài)較為均一(x200)、璐C培養(yǎng)基的選擇和CFUeeF側(cè)定本實(shí)驗(yàn)研究顯示對(duì)于5一6周齡的Balb/c小鼠，單純DMEMesLG培養(yǎng)基s克隆集落較大且集落數(shù)量較多，CFU一F為2.71/106個(gè)骨艘細(xì)胞:克隆集落較小，CFU一為2.13/106個(gè)骨艘細(xì)胞:而D班】/F12培養(yǎng)基大并且數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)較好，CFU一F為4.9/106個(gè)骨髓細(xì)胞;QCs呈彌漫分布，克隆集落較多，CFU一F為4.5/106個(gè)骨健細(xì)胞。經(jīng)代后，DME腳F12和。挑M培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSCs在細(xì)胞密度依賴性的長(zhǎng)形態(tài)及活力優(yōu)于DMI繃一LG和IMDM培養(yǎng)基，故本實(shí)驗(yàn)選用QMEM培養(yǎng)研究。

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 秦小惠;移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)乳腺炎模型大鼠乳腺作用的研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2779311