【摘要】： 支氣管哮喘是以氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥及氣道重建為特征的慢性疾病。氣道重建可導(dǎo)致不可逆的氣道阻塞和持續(xù)性的氣道高反應(yīng)性[1-3],它包括上皮下膠原沉積,黏液細(xì)胞增生/化生,平滑肌的增生和肥厚等,是目前難治性哮喘的重要病理基礎(chǔ)之一。已有研究證實(shí)氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell, ASMC)的增殖是氣道重建(airway remodelig)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),ASMC作為氣道重建的主要成分,通過(guò)自身的異常增殖參與整個(gè)過(guò)程[4-6]。因此,探討支氣管哮喘ASMC的異常增殖的調(diào)控機(jī)制是研究支氣管哮喘氣道重建發(fā)生機(jī)制的重要方向,抑制ASMC的異常增殖可成為治療難治性哮喘的重要思路。但既往的研究多集中在探討各種生物刺激(如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等)對(duì)ASMC功能的影響及最終產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng),有關(guān)生物信息在ASMC內(nèi)傳遞機(jī)制的研究則相對(duì)較少。 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通道是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道,聯(lián)系著細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞核反應(yīng)間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo),參與多種細(xì)胞異常增殖與分化的信號(hào)調(diào)控[7]。ERK是該通道中的關(guān)鍵酶,它有多種亞型,在平滑肌細(xì)胞中主要為ERK1、ERK2(ERK1/2)兩種亞型分布。研究表明,在探討血管重建機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),ERK1/2通道是介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)異常增殖的重要信號(hào)通道[8]。它參與調(diào)控VSMC的表型變化、遷移、增殖、凋亡和分泌等活性[9,10]。那么,哮喘氣道重建中是否也存在血管重建中的類似機(jī)制,即哮喘ASMC內(nèi)ERK1/2的活性是否也介導(dǎo)了ASMC異常增殖生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?目前國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立大鼠慢性哮喘模型,體外培養(yǎng)ASMC,探討哮喘ASMC增殖活性的變化及ERK1/2在該增殖變化中的作用,從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度研究ERK通道在哮喘ASMC增殖調(diào)控中的意義,為進(jìn)一步闡明哮喘氣道重建的病理生理學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù),為尋求更為有針對(duì)性的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容: 1.建立大鼠慢性哮喘模型,病理圖像分析慢性哮喘大鼠氣道重建,免疫組化法檢測(cè)ERK和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在肺內(nèi)表達(dá),激光共聚焦顯微鏡分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK)和PCNA在氣道平滑肌上共表達(dá),免疫印跡檢測(cè)氣道平滑肌上ERK和PCNA蛋白的表達(dá),原位雜交檢測(cè)氣道平滑肌中ERK和PCNA的mRNA表達(dá),從而探討ERK是否在慢性哮喘大鼠氣道平滑肌上表達(dá)。 2.建立大鼠慢性哮喘模型,體外培養(yǎng)哮喘ASMC,以ERK激動(dòng)劑表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和抑制劑PD98059作為工具藥物,采用流式細(xì)胞儀、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、3H-TdR摻入法、PCNA免疫組織化學(xué)觀察ASMC的增殖,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(cyclin) D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈測(cè)定(RT-PCR)和Western免疫印跡檢測(cè)ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。從而探討哮喘ASMC增殖活性的變化及ERK1/2在該增殖變化中的作用。 3.體外培養(yǎng)哮喘ASMC,以ERK激動(dòng)劑表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和抑制劑PD98059作為工具藥物,用原位末端標(biāo)記法和Annexin-V FITC PI雙染色法觀察ASMC凋亡,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達(dá),用Western免疫印跡檢測(cè)半胱天冬酶(caspase)-3蛋白的表達(dá)。從而探討哮喘ASMC凋亡變化及ERK1/2在該凋亡變化中的作用。 4.設(shè)計(jì)合成ERK反義寡核苷酸(ODN),體外培養(yǎng)哮喘ASMC,利用脂質(zhì)體將正義、反義及錯(cuò)配ERK1 ODNs導(dǎo)入ASMC,用流式細(xì)胞儀、MTT法、3H-TdR摻入法檢測(cè)不同寡核苷酸對(duì)ASMC增殖的抑制作用,原位末端標(biāo)記法和Annexin-V FITC PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,RT-PCR和Western免疫印跡檢測(cè)ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2、PCNA蛋白的表達(dá)。觀察反義核酸對(duì)哮喘ASMC增殖和凋亡的干預(yù)。 結(jié)果: 1.病理圖像分析顯示慢性哮喘大鼠有氣道平滑肌層增厚,出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重建。免疫組化法檢測(cè)顯示ERK和PCNA在肺內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),激光共聚焦顯微鏡分析ERK1/2、p-ERK1/2和PCNA在氣道平滑肌上共表達(dá),免疫印跡和原位雜交檢測(cè)顯示在氣道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白與mRNA表達(dá)增加。 2.與對(duì)照組ASMC比較,哮喘組ASMC的G0/G1期所占細(xì)胞的比例明顯減少,S + G2/M期細(xì)胞所占比例增高,吸光度值( A_(490) )、細(xì)胞DNA合成量、PCNA陽(yáng)性表達(dá)量、cyclin D1和CDK2蛋白表達(dá)量均明顯增加。與對(duì)照組ASMC比較,哮喘組ASMC的ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量以及ERK活化率(%)均顯著增高。經(jīng)PD98059干預(yù)之后,哮喘組ASMC的S + G2/M期細(xì)胞所占比例、A490值、細(xì)胞DNA合成量、PCNA陽(yáng)性表達(dá)量、cyclin D1和CDK2蛋白表達(dá)量明顯降低,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量以及ERK活化率(%)均顯著下降。經(jīng)EGF干預(yù)之后,哮喘組ASMC的S + G2/M期細(xì)胞所占比例、A490值、細(xì)胞DNA合成量、PCNA陽(yáng)性表達(dá)量、cyclin D1和CDK2蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增高,而這一作用可以被PD98059所抑制。 3.與對(duì)照組ASMC比較,哮喘組ASMC凋亡指數(shù)、早期凋亡細(xì)胞百分率明顯下降,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量以及ERK活化率(%)亦顯著增高。經(jīng)PD98059干預(yù)之后,哮喘組ASMC的凋亡指數(shù)與早期凋亡細(xì)胞百分率、bax蛋白表達(dá)量和caspase-3蛋白含量明顯增高,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量以及ERK活化率(%)亦顯著降低。經(jīng)EGF干預(yù)之后,哮喘組ASMC凋亡指數(shù)與早期凋亡細(xì)胞百分率進(jìn)一步下降,而這一作用可以被PD98059所抑制。 4.反義ODNs組的G0/G1期所占細(xì)胞的比例明顯增高,S + G2/M期細(xì)胞所占比例明顯減少,A490值、細(xì)胞DNA合成量、PCNA蛋白表達(dá)量、ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量以及ERK活化率(%)均明顯減少,與哮喘組各值比較差異均有顯著性(P0.05)。反義ODNs組的凋亡指數(shù)和早期凋亡細(xì)胞百分率明顯增高,與哮喘組各值比較差異均有顯著性(P0.05)。而正義和錯(cuò)配ERK1 ODNs沒(méi)有上述作用。 結(jié)論: 1.慢性哮喘大鼠有氣道平滑肌層增厚,出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重建。慢性哮喘大鼠氣道重建模型復(fù)制成功; 2.慢性哮喘大鼠中ERK和PCNA在肺內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)在氣道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白與mRNA表達(dá)增加。提示ERK可能是介導(dǎo)慢性哮喘氣道重建中平滑肌增殖的重要信號(hào)通路之一。 3.慢性哮喘ASMC內(nèi)源性增殖`活性增加,同時(shí)ERK1/2表達(dá)及活化率均顯著增強(qiáng)。ERK1/2通過(guò)誘導(dǎo)cyclinD1和CDK2蛋白高表達(dá),使細(xì)胞從G1期向S期發(fā)展,細(xì)胞增殖。ERK信號(hào)通道在哮喘氣道重建的ASMC增殖調(diào)控中具有重要作用。 4.慢性哮喘組大鼠ASMC內(nèi)源性增殖活性增加的同時(shí),伴有凋亡活性下降。ERK1/2參與慢性哮喘ASMC凋亡調(diào)控,其機(jī)制與bcl-2家族和caspace-3有關(guān)。 5.反義ERK1 ODNs可通過(guò)抑制ERK mRNA表達(dá)和翻譯來(lái)抑制慢性哮喘大鼠ASMC的增殖,促進(jìn)其凋亡。 由此可見(jiàn),ERK1/2信號(hào)通道是介導(dǎo)哮喘ASMC異常增殖的重要信號(hào)通道,對(duì)哮喘ASMC增殖與凋亡起調(diào)控作用。ERK信號(hào)通道可能通過(guò)細(xì)胞周期、bcl-2家族以及caspace-3對(duì)哮喘ASMC增殖與凋亡起調(diào)控作用。這為研究哮喘氣道重建的發(fā)病機(jī)理提供新的理論,也為將來(lái)治療難治性哮喘提供一定的新思路。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R562.25
【圖文】：

圖 1：健康對(duì)照組細(xì)支氣管平滑�。℉E×100）；圖 2：哮喘模型組細(xì)支氣管平滑�。℉E×100）.Fig 1：The bronchial smooth muscle in control group ( HE staining×100）；Fig 2：The bronchial smoothmuscle in chronic asthmatic group（HE staining×100）.1 2 3p-ERK1（42kd）p-ERK2（44kd）1 2 3ERK1（42kd）ERK2（42kd）PCNA（36kd）1 2 3

圖 1：健康對(duì)照組細(xì)支氣管平滑�。℉E×100）；圖 2：哮喘模型組細(xì)支氣管平滑�。℉E×100）.Fig 1：The bronchial smooth muscle in control group ( HE staining×100）；Fig 2：The bronchial smoothmuscle in chronic asthmatic group（HE staining×100）.1 2 3p-ERK1（42kd）p-ERK2（44kd）1 2 3ERK1（42kd）ERK2（42kd）PCNA（36kd）1 2 3

平滑�。℉E×100）；平滑�。℉E×100）.h muscle in control group ( HE staining×100） group（HE staining×100）.① ②1 2 3）

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 安欣;MAPK家族成員活化表達(dá)參與高血壓心臟重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2772570