【摘要】：一、研究目的:構(gòu)建Nox1啟動(dòng)子活性表達(dá)載體pGL6-Nox1,探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用;篩選TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞GSTM5核內(nèi)差異結(jié)合蛋白;探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3谷胱甘肽化水平的作用。二、研究方法1、探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。(1)構(gòu)建pGL6-Nox1質(zhì)粒提取人外周血DNA,PCR得到Nox1啟動(dòng)子-1415~0片段,經(jīng)Xho I與Hind III雙酶切pGL6載體回收線性pGL6片段,pGL6片段與Nox1片段經(jīng)DNA連接酶連接過夜后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)后鋪篩選平板,培養(yǎng)12h后挑選菌落,提取質(zhì)粒雙酶切鑒定,并送測(cè)序。(2)上調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用實(shí)驗(yàn)分4組:過表達(dá)GSTM5組:16HBE-GSTM5-N與16HBE-GSTM5-C組,陰性對(duì)照組16HBE-NC與空白對(duì)照16HBE組。所有分組每孔均轉(zhuǎn)染pGL6-Nox1(500ng),pRL-TK(50ng)雙熒光素酶質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6h后各組細(xì)胞中刺激組培養(yǎng)液更換為10 ng/mL TNF-α的DMEM培養(yǎng)基,陰性組更換為DMEM培養(yǎng)基。24h后收取各組蛋白上機(jī)檢測(cè),比較TNF-α刺激后各組的Nox1相對(duì)熒光素酶活性上升比率。(3)下調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用實(shí)驗(yàn)分3組:GSTM5低表達(dá)組:轉(zhuǎn)染GSTM5siRNA;陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染control siRNA;空白對(duì)照組:只轉(zhuǎn)染pGL6-Nox1,pRL-TK質(zhì)粒。所有分組每孔均轉(zhuǎn)染pGL6-Nox1(500ng),pRL-TK(50ng)雙熒光素酶質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6h后各組細(xì)胞中刺激組培養(yǎng)液更換為10 ng/mL TNF-α的DMEM培養(yǎng)基,陰性組更換為DMEM培養(yǎng)基。24h后收取各組蛋白上機(jī)檢測(cè),比較TNF-α刺激后各組的Nox1相對(duì)熒光素酶活性上升比率。2、篩選TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞GSTM5核內(nèi)差異結(jié)合蛋白將GSTM5穩(wěn)轉(zhuǎn)株分2組:GSTM5-N組與GSTM5-C組,每組再分實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞。用SILAC重鏈同位素培養(yǎng)基培養(yǎng)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,SILAC輕鏈同位素培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)照細(xì)胞,培養(yǎng)至同位素標(biāo)記效率達(dá)95%以上后,實(shí)驗(yàn)組更換為10ng/ml TNF-α相對(duì)應(yīng)的重鏈同位素培養(yǎng)液培養(yǎng),對(duì)照組更換為無TNF-α相對(duì)應(yīng)的輕鏈同位素培養(yǎng)液培養(yǎng),0.5h后收集細(xì)胞,每組中的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別取等量的細(xì)胞混合并提取核蛋白,蛋白混合物用flag抗體做免疫共沉淀;兩組共沉淀蛋白復(fù)合物分別經(jīng)過質(zhì)譜鑒定和比較分析,得到在TNF-α刺激與無刺激條件下GSTM5蛋白的互作蛋白并進(jìn)行篩選。3、探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3谷胱甘肽化水平的調(diào)節(jié)作用(1)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3谷胱甘肽化水平時(shí)間變化趨勢(shì)將16HBE細(xì)胞分為TNF-α刺激0小時(shí)組、0.5小時(shí)組、1小時(shí)組、6小時(shí)組、12小時(shí)組和24小時(shí)組。用含TNF-α10ng/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)各組細(xì)胞至相對(duì)應(yīng)時(shí)間結(jié)束收集細(xì)胞。所有分組細(xì)胞均用酸提法提取細(xì)胞核內(nèi)組蛋白,蛋白印跡法檢測(cè)各組組蛋白H3蛋白谷胱甘肽化水平。(2)上調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞組蛋白H3的谷胱甘肽化水平的調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)分三組:過表達(dá)組:GSTM5穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞;陰性對(duì)照組:穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)照細(xì)胞;空白對(duì)照組:16HBE細(xì)胞組。各組內(nèi)再分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組用TNF-α(10 ng/mL)刺激12小時(shí),對(duì)照組不加任何刺激,正常培養(yǎng)。在刺激12h后上收取所有細(xì)胞,酸提法提取細(xì)胞核組蛋白,蛋白印跡法檢測(cè)各組TNF-α刺激前后核內(nèi)組蛋白H3蛋白谷胱甘肽化水平變化。三、研究結(jié)果1、構(gòu)建Nox1熒光素酶表達(dá)載體pGL6-Nox1,探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用(1)構(gòu)建Nox1熒光素酶表達(dá)載體pGL6-Nox1提取的pGL6-Nox1質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ或Hind III單酶切后電泳呈一長約7000 bp線性條帶;經(jīng)XhoⅠ、Hind III雙酶切后電泳見兩條亮帶,其一亮帶長1415 bp的為Nox1啟動(dòng)子,另一亮帶長約5580 bp為pGL6載體。經(jīng)Nox1引物PCR得到一長約1415bp的片段。經(jīng)華大基因測(cè)序后與人Nox1啟動(dòng)子完全比對(duì)。證實(shí)pGL6-Nox1質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)上調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用結(jié)果:GSTM5-N及GSTM5-C組Nox1相對(duì)熒光素酶活性上調(diào)比率均較陰性對(duì)照組、空白組低(1.7100±0.0657,1.6733±0.0757,1.9467±0.0472,2.115±0.109),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);GSTM5-N與GSTM-C組之間相對(duì)熒光素酶活性上調(diào)比率對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)下調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞Nox1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用GSTM5低表達(dá)組相對(duì)熒光素酶活性上調(diào)比率較空白對(duì)照組,陰性對(duì)照組均高(2.633±0.0808,1.8400±0.1039,1.9467±0.1011,P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、篩選TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞GSTM5核內(nèi)差異結(jié)合蛋白(1)質(zhì)譜鑒定共沉淀下的蛋白復(fù)合物通過質(zhì)譜鑒定分析,并取兩組細(xì)胞的共有蛋白,經(jīng)過篩選得到16種蛋白。分別為皮離蛋白(Dermcidin)、橋粒斑蛋白(Desmoplakin)、組蛋白H3F3C(histoneH3)、高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein B1)、H2aj(Histone cluster 1,H2aj)、脂肪酸結(jié)合蛋白5(Fatty acid binding protein5)、連接橋粒斑珠蛋白(Junction plakoglobin)、纖溶酶原激活物抑制劑1 RNA結(jié)合蛋白(SERPINE1 mRNA binding protein 1)、膜結(jié)合蛋白A2(Annexin A2)、H2bl(Histone cluster 1,H2bl)、肌動(dòng)蛋白(Actin,gamma 1)、H1b(Histone cluster 1,H1b)、核仁螺旋體磷酸化蛋1(Nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1)、H1e(Histone cluster 1,H1e)、絲氨酸蛋白3(Protease,serine,3)、及鈣調(diào)蛋白樣蛋白5(Calmodulin-like 5)。(2)蛋白一級(jí)相互作用分析通過蛋白STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜鑒定篩選出的16種蛋白進(jìn)行一級(jí)相互作用分析,其中組蛋白Histone H3F3C、組蛋白H2aj、組蛋白H2bl、組蛋白H1b、組蛋白H1e、高遷移率族蛋白B1、鈣調(diào)蛋白樣蛋白5及肌動(dòng)蛋白之間存在相互關(guān)系,連接橋粒斑珠蛋白與橋粒斑蛋白之間存在相互作用關(guān)系。3、探究GSTM5對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3谷胱甘肽化修飾水平調(diào)節(jié)作用(1)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3谷胱甘肽化水平的時(shí)間變化趨勢(shì)Western blot結(jié)果經(jīng)灰度值分析后顯示:人支氣管上皮細(xì)胞組蛋白H3谷胱甘肽化水平隨TNF-α刺激在0小時(shí),0.5小時(shí),1小時(shí),6小時(shí)內(nèi)逐漸降低,12小時(shí)相有所回升,24小時(shí)相再次降低(0.43±0.04,0.36±0.1,0.24±0.09,0.27±0.03,0.35±0.06,0.24±0.1)。(2)上調(diào)GSTM5表達(dá)對(duì)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H3的谷胱甘肽化水平的影響Western blot結(jié)果經(jīng)灰度值分析后顯示:TNF-α刺激人支氣管上皮細(xì)胞12h后,GSTM5過表達(dá)組組蛋白H3谷胱甘肽水平變化較陰性對(duì)照組及空白組高(1.37±0.06,0.9±0.12,0.84±0.11,P0.05)。四、結(jié)論GTSM5可下調(diào)TNF-α介導(dǎo)的16HBE細(xì)胞Nox1氧化酶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,其機(jī)制可能與GSTM5在TNF-α誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)位后調(diào)節(jié)組蛋白H3的谷胱甘肽化水平有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;R563
【圖文】：

圖 1-1：質(zhì)粒電泳圖A ladder line2：PGL6-Nox1 質(zhì)粒 line3：XhoI 酶切 line4：HinII 雙酶切 line6：質(zhì)粒 PCR

圖 1-2： pGL6-Nox1 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果2 GSTM5 對(duì) TNF-α介導(dǎo)的 16HBE 細(xì)胞 Nox1 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的作用2.1 上調(diào) GSTM5 表達(dá)對(duì) TNF-α介導(dǎo)的 16HBE 細(xì)胞 Nox1 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)作用

P=0.472），見圖 1-3。:Nox1 相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)（n=4， x±s）Control TNF-α 合計(jì) F 值 P 值 歸變13.932±1.60227.442±3.06120.68±7.56661.125 0.0001 1.97118.674±2.00139.368±2.74429.02±11.282148.489 0.0002 2.115 30.860±3.14951.880±4.10641.370±11.73565.982 0.0001 1.684 27.250±1.98146.657±1.91236.954±10.528198.768 0.0002 1.71522.679±7.22341.337±9.85932.008±12.732F=385.157#P＜0.000#F=3.394*P=0.034* 值 P 值，*交互作用 F 值 P 值

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本文編號(hào)：2772061