【摘要】： Alpha-黑素細胞刺激素(alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是由其前體——阿黑皮素原(proopiomelanoeortin)裂解產(chǎn)生,其通過與黑皮素受體(melanocortin receptor,MCR)結(jié)合而發(fā)揮作用。α-MSH具有很強的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH具有獨特的抗炎特點:它可直接作用于腦細胞,抑制腦局部促炎癥細胞因子的產(chǎn)生,保護神經(jīng)元功能;通過下行神經(jīng)通路抑制細菌內(nèi)毒素誘導的外周循環(huán)中促炎癥細胞因子生成;又可直接作用于外周組織細胞,抑制促炎癥細胞因子的產(chǎn)生及活性。α-MSH抑制多種類型的人體細胞產(chǎn)生細胞因子和其他的炎癥介質(zhì),包括NO和前列腺素等。α-MSH不是完全消除炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,而是適度地抑制其生成量,可以減輕炎癥反應程度但卻不損害宿主的防御能力。α-MSH的抗炎作用在某種程度上是通過抑制核因子NF-κB完成的。但是α-MSH作為抗炎免疫調(diào)節(jié)劑,本身也存在缺點,其對MC1-R和MC3-R有較高的選擇性,對MC4-R和MC5-R的親和力很低。我室研制的新型α-MSH類似物顯示出對MC1-R和MC5-R的選擇性,能減少一定的副作用。 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)是一種常見危重癥,病死率極高,嚴重威脅重癥患者的生命并影響其生存質(zhì)量。ALI/ARDS是在嚴重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中,肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。以肺容積減少、肺順應性降低、嚴重的通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征,臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫,肺部影像學上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變。流行病學調(diào)查顯示ALI/ARDS是臨床常見危重癥。盡管ARDS已經(jīng)研究了近40年,臨床重癥監(jiān)護在期間取得了長足的進步。然而ARDS的死亡率仍高達40%～60%。人們對于ALI/ARDS發(fā)病機理的研究從未間斷,當務之急是建立趨于完善的模擬臨床的動物模型。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)不同原因所致ALI/ARDS的發(fā)病原理及病理過程可能會有很大的不同,因而對ALI/ARDS致病動物模型的選用至關(guān)重要。目前認為“兩次打擊理論”更能反映體內(nèi)的實際發(fā)病情況。此理論認為嚴重多發(fā)骨折等創(chuàng)傷作為第1次打擊使機體處于中等狀態(tài)的全身炎癥反應綜合征,此時如果遭受感染因素或不恰當復蘇、手術(shù)打擊、再次致傷因素等第二次打擊,放大了已存在的炎癥狀態(tài)而發(fā)生過度的全身炎癥反應綜合征,會繼發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征以及多器官功能障礙綜合征。失血性休克與內(nèi)毒素血癥都是臨床多發(fā)病,特別是對于戰(zhàn)傷,更具有重要的實際意義。因此,本研究選擇了先失血性休克,1h后再氣道內(nèi)直接滴入LPS的方式來建立大鼠ALI模型,這樣可以造成直接的肺損傷為主的ALI模型。 近年來,許多研究人員對α-MSH在各種臟器炎癥中的作用進行了大量的研究并給予了充分的肯定。但是,新型α-MSH類似物在ALI/ARDS中是否有保護作用仍未可知。因此,本課題采用大鼠的二次打擊ALI模型研究我室的新型α-MSH類似物對大鼠急性肺損傷的保護作用,并試圖探討一些新的作用機制,同時以α-MSH作為對照。首先是建立大鼠失血性休克+LPS二次打擊模型,即采用自制的裝置從大鼠頸動脈放血,在15 min內(nèi)使血壓降至40 mmHg,并維持此血壓1h。之后,在2h內(nèi)將全部失血回輸至體內(nèi),并補充適當?shù)纳睇}水以恢復到最初的壓力水平。休息1h后,再從氣管內(nèi)滴入LPS進行二次打擊,完成ALI模型的制作并維持6h。另有動物除了給予LPS外,還同時給予α-MSH或α-MSH類似物,觀察其保護作用。這樣可將動物分為四組,即假手術(shù)(sham)組,LPS組以及LPS+α-MSH組和LPS+α-MSH類似物組。實驗結(jié)束后,采用放血法處死大鼠,分別收集血漿、肺泡灌洗液(BALF)及肺組織待檢。本實驗采用HE染色觀察了各組肺組織的病理改變情況;采用ELISA分別檢測了BALF中的TNF-α、IL-1β、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)及IL-10的濃度;采用化學法測定了BALF和肺組織中LDH、MDA、MPO、總蛋白含量和SOD的活性;采用免疫組化(Immunohistochemistry)方法觀察了肺組織的P-選擇素(P-selectin)的表達情況;用Western Blot檢測了肺組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)水平變化;以Real-time PCR方法檢測了纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、細胞因子誘導中性粒細胞化學趨化因子-1(CINC-1)、Clara細胞蛋白(CC16)、血紅素加氧酶-1(HO-1)等的表達。結(jié)果顯示:與sham組比較,LPS組肺組織損傷嚴重,出現(xiàn)肺泡壁增厚,炎細胞浸潤并伴有輕度水腫等病理改變,α-MSH類似物和α-MSH能明顯改善這種情況。BALF中TNF-α、IL-1β、MIF、總蛋白含量和LDH代表了肺內(nèi)炎癥狀況,前三者為促炎因子,LDH與總蛋白含量相互配合常用來表示肺組織的損傷程度。MDA和SOD反應了肺內(nèi)的氧化應激水平。肺組織中MPO是用來反映中性粒細胞浸潤的一個比較靈敏的指標。在二次打擊后,這幾項指標顯著增高(P＜0.05),而抗炎因子IL-10則無明顯降低(P＞0.05),由于其作用的復雜性,其在ALI中的作用還有待于進一步研究。P-選擇素在中性粒細胞黏附血管壁的過程中起著很重要的作用,免疫組化結(jié)果表明,在給予LPS后,P-選擇素表達量增加,同時給予α-MSH類似物或α-MSH則能抑制其表達。大量研究證實,纖溶系統(tǒng)參與了ALI的發(fā)生過程,其中PAI-1最為關(guān)鍵。ALI的一個顯著特征就是大量的中性粒細胞在肺內(nèi)被扣押,而CINC-1是大鼠體內(nèi)最重要的中性粒細胞趨化因子,類似于人體內(nèi)的IL-8。HO-1和CC16是兩個肺內(nèi)有著重要作用的抗炎因子。Real-time PCR結(jié)果顯示,二次打擊后肺組織內(nèi)PAI-1、CINC-1和HO-1 mRNA水平顯著上調(diào),CC16則下調(diào),α-MSH類似物和α-MSH均能抑制前三者的上調(diào)和抑制CC16的下調(diào)(P＜0.05)。 本課題的創(chuàng)新點在于:①研究了我室自主設計的新型α-MSH類似物對急性肺損傷的保護作用,各種實驗結(jié)果表明:α-MSH類似物與α-MSH都能有效地抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、粘附分子P-選擇素、趨化因子CINC-1以及纖溶系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子PAI-1上調(diào),以及能顯著地促進抗炎因子HO-1的活性,顯示了其抗炎特性。②對α-MSH這種神經(jīng)內(nèi)分泌肽調(diào)節(jié)炎癥的作用機制有新的探討,揭示出α-MSH在趨化因子,粘附分子及纖溶系統(tǒng)方面以前不為人所知的抗炎機制。ALI中最關(guān)鍵的因素是中性粒細胞的浸潤,而P-選擇素在中性粒細胞穿越內(nèi)皮細胞的過程中起著重要的作用,介導了中性粒細胞于肺微循環(huán)內(nèi)皮細胞的起始粘附,而α-MSH類似物能有效地抑制這一過程。PAI-1是體內(nèi)纖溶系統(tǒng)中最重要的抑制物,對于穩(wěn)定體內(nèi)正常的血流起著很重要的作用。肺纖溶活性異常是急性和慢性炎癥性腫損傷的共同表現(xiàn)。α-MSH能夠有效地抑制PAI-1的上調(diào),促進血液循環(huán)正常化,緩解腫部炎癥。CINC-1是大鼠體內(nèi)最重要的中性粒細胞趨化因子,而α-MSH也能有效地阻止其上調(diào),這對于抑制中性粒細胞向肺部遷徙和穿越起著不可估量的作用。本課題還研究了與肺部關(guān)系密切的兩個抗炎因子:HO-1和CC16。α-MSH可以促進CC16的上調(diào)和HO-1的下調(diào),這對于判定ALI的病情也具有一定的幫助。③本研究還改進了動物模型的制作。以往的2次打擊模型,死亡率高,穩(wěn)定性和重復性很難令人滿意,加之動物個體之間有很大的差異,用這樣的模型很難得出令人信服的結(jié)論。本研究采用自動調(diào)整血壓的裝置代替注射器抽取,這樣更宜于使血壓保持穩(wěn)定,減少大鼠的死亡率,采用定壓和定容相結(jié)合的辦法,來彌補僅基于一項指標的動物模型的不足。實驗證明這是一種很好的控制動物失血休克的方法。采用這一方法能最大程度地減少動物的個體差異。既能使血壓穩(wěn)定在某一水平又能保證一定的失血量,更加真實地模擬了休克過程。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R563.8
【圖文】：

位論文75%的乙醇溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。09離心5min，去上清，RNA沉淀于管底。燥(晾十)5一10min。HZO(DEpC處理后高)1;火菌)或TE緩字，!’液濟解RN員檢測:各樣.鉆A26()/A28(。比值在!.8一2.0之i‘日，濃)泛甲{}嶸變性膠檢測結(jié)果見圖

sham組肺組織病理學檢杳HE染色A:X100;B:XZOntativePhotomierograPhsofltmgshistologyinshamgrouP.Hmagnifieation:A:X100;B:XZOO:C:X40O

合尼康eoolpix4500照相機拍攝。以清楚地看到，LPS組P一selectin表達比其它三組顯著增多，而Shanalogue組則少量表達，而且相互之間差異不明顯。F總蛋白(孔talProtein)，LDH的含量最基本的病理生理改變就是肺血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞屏性的增加，進而導致肺泡內(nèi)外液體轉(zhuǎn)運失衡。動物實驗證實這種于肺血管內(nèi)皮細胞的改變。檢測肺泡壁的損傷程度有很多種方法檢測BALF中總蛋白和LDH的方法[3]�？偟鞍状矸蔚耐ㄍ感苑N細胞溶質(zhì)中的酶，其在BALF中含量升高被認為是山于細胞破壞看到，給予LPS后，肺損傷比較嚴重。若先給予a一MSH和新型類二者的含量(圖10一11)。

【共引文獻】

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本文編號：2767052