【摘要】： 支氣管哮喘是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病,多發(fā)病。目前認(rèn)為,支氣管哮喘是以氣道可逆性阻塞、高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的一組綜合征,氣道炎癥是前兩者的基礎(chǔ)。在多種遺傳和環(huán)境因素共同作用下,經(jīng)過巨噬細(xì)胞(包括樹突狀細(xì)胞)的抗原呈遞作用,Na(?)ve T輔助細(xì)胞(Th 0)被活化,分化為Th 2細(xì)胞,釋放IL-4、IL-5、IL-13等多種Th 2細(xì)胞因子,促進(jìn)了支氣管哮喘的形成和發(fā)展。其中IL-13是一種重要的Th2細(xì)胞因子,它通過誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥、增加氣道高反應(yīng)性、促進(jìn)粘液分泌,并參與了哮喘氣道重建,成為支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要介質(zhì)。但迄今為止,對IL-13基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。 T細(xì)胞是產(chǎn)生IL-13的主要來源。CD3/CD28雙信號通路對T細(xì)胞的刺激能夠模擬T細(xì)胞在體內(nèi)受抗原活化產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子的過程。轉(zhuǎn)錄因子在基因的表達(dá)和調(diào)控上具有核心作用,GATA3是Th2細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子,細(xì)胞中增高的GATA3能夠同時促進(jìn)Th2細(xì)胞中IL-4、IL-5和IL-13的基因表達(dá)。許多研究表明在IL-13基因啟動子區(qū)域GATA位點(diǎn)對IL-13的基因表達(dá)起重要作用�；罨疶細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)是TCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。我們的前期研究表明在CD3/CD28雙信號通路刺激后NFAT1與IL-13啟動子結(jié)合增強(qiáng)。在人IL-13基因啟動子區(qū)域GATA3與NFAT1位點(diǎn)鄰近,作為同時參與IL-13基因轉(zhuǎn)錄的GATA3和NFAT1間是否存在相互作用?如何相互作用?均值得進(jìn)一步探討。本課題通過研究T細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28活化后觀察GATA3和NFAT1在IL-13啟動子區(qū)域功能上的相互作用,探索IL-13基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制,并進(jìn)一步研究糖皮質(zhì)激素丙酸氟替卡松(Fluticasonepropionate,FP)和傳統(tǒng)哮喘治療藥物三氧化二砷(Arsenic Troxide,AT)對該相互作用的影響。 第一部分GATA3-NFAT1相互作用在人活化T細(xì)胞IL-13基因表達(dá)中的作用 目的:研究T細(xì)胞在CD3/CD28雙信號通路共刺激活化后,細(xì)胞內(nèi)GATA3與NFAT1的結(jié)合情況及NFAT1抑制劑FK-506對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響,探討GATA3-NFAT1相互作用在T細(xì)胞IL-13基因表達(dá)中的作用。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)雙信號通路對Hut-78細(xì)胞進(jìn)行共刺激,分別在0min、30min、1h、2h時采用免疫共沉淀(IP)的方法觀察GATA3與N-FAT1結(jié)合情況及FK-506對兩者結(jié)合的影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法研究NFAT1被FK-506阻斷后GATA3與IL-13啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。 結(jié)果:Hut-78細(xì)胞在CD3/CD28共刺激活化后,細(xì)胞內(nèi)NFAT1和GATA3結(jié)合增強(qiáng),在刺激30min時兩者即有結(jié)合,隨著刺激時間的延長在1h、2h時兩者結(jié)合有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢,呈明顯的時間依賴性。FK-506(1n M)組在30min、1h、2h時均能抑制NFAT1與GATA3的結(jié)合,以2h時抑制更為明顯(2.25±0.1 VS 1.18±0.09),P＜0.05。用FK-506對NFATl進(jìn)行抑制后,GATA3與IL-13的啟動子區(qū)域結(jié)合減弱。T細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28免疫共刺激活化30分鐘時FK-506抑制GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的作用不明顯,而在1h時能夠抑制GATA3同IL-13啟動子的結(jié)合(3.95±0.26 VS 2.82±0.44),2h時這種抑制效應(yīng)更為明顯,其抑制效應(yīng)約為50%(4.34±1.42 VS 1.73±0.09),P＜0.05。 結(jié)論:T細(xì)胞經(jīng)過CD3/CD28共刺激活化后細(xì)胞內(nèi)NFAT1和GATA3結(jié)合增強(qiáng),FK-506能抑制兩者的結(jié)合。FK-506能抑制GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合。FK-506可能通過影響兩者的結(jié)合,抑制了GATA3對IL-13基因轉(zhuǎn)錄的啟動。 第二部分:FP抑制活化T細(xì)胞IL-13基因表達(dá)的機(jī)制 目的:研究T細(xì)胞在CD3/CD28共刺激活化后,FP對NFAT1和GATA3結(jié)合的影響及FP對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響,探討FP抑制活化T細(xì)胞中IL-13基因表達(dá)的可能機(jī)制。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5gg/ml)雙信號通路對Hut-78細(xì)胞進(jìn)行共刺激,分別在0min、30min、1h、2h時采用免疫共沉淀(IP)的方法觀察GATA3與NFAT1結(jié)合情況及FP對兩者結(jié)合的影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法研究FP對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響。 結(jié)果:與對照組相比,經(jīng)CD3/CD28刺激組GATA3與NFAT1結(jié)合增強(qiáng),且在30min、1h、2h各時間點(diǎn)逐漸增高,呈時間依賴性。FP(10~(-8)M)能夠部分抑制GATA3與NFAT1的結(jié)合,在細(xì)胞活化30min(1.33±0.08VS 0.91±0.083)、1h(1.97±0.18 VS 1.56±0.13)、2h(2.65±0.18 VS 1.80±0.23)時FP均可抑制兩者的結(jié)合(P＜0.05)。HUT-78細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28雙信號通路共刺激活化后在30min、1h及2h各時間點(diǎn)GATA-3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合逐漸增強(qiáng)。FP在細(xì)胞活化1h能顯著抑制GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合(8.19±2.1 8 VS 2.69±1.33),P＜0.05。 結(jié)論:T細(xì)胞經(jīng)過CD3/CD28活化后GATA3與NFAT1結(jié)合增強(qiáng),并促進(jìn)GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合。FP可能部分通過影響GATA3和NFAT1的相互作用,抑制T細(xì)胞IL-13基因表達(dá)。 第三部分:砷劑對活化T細(xì)胞IL-13基因表達(dá)的影響 目的:研究T細(xì)胞在CD3/CD28雙信號通路刺激后IL-13的基因表達(dá)以及三氧化二砷對該基因表達(dá)的影響,并探討三氧化二砷(AT)抑制IL-13基因表達(dá)的可能機(jī)制。 方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)雙信號通路對Hut-78細(xì)胞進(jìn)行共刺激,在30min及19h時用RT-PCR方法觀察IL-13mRNA表達(dá)及AT對IL-13mRNA表達(dá)的影響,并采用IP方法觀察在細(xì)胞活化0min、30min、1h、2h時GATA3與NFAT1結(jié)合情況及AT對兩者結(jié)合的影響。 結(jié)果:CD3/CD28雙信號通路共刺激后,Hut-78細(xì)胞的IL-13mRNA表達(dá)增加,在19h時砷劑(5μM)能夠明顯抑制該基因的表達(dá)(6.77±2.78 VS 2.24±0.57),P＜0.05。Hut-78細(xì)胞在經(jīng)過CD3/CD28免疫活化30分鐘后,GATA3和NFATl兩者即有結(jié)合且在2小時內(nèi)兩者結(jié)合呈逐漸增強(qiáng)趨勢,AT在2h時能夠部分抑制兩者的結(jié)合(2.47±1.83VS 1.41±1.11,P＜0.05。 結(jié)論:對Th2細(xì)胞IL-13基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制可能是AT平喘抗炎的機(jī)制之一,該過程可能是通過部分抑制GATA3和NFAT1兩者相互作用實現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R562.25
【圖文】：

N碑訂1和GATA3結(jié)合情況。與對照組相比，在刺激30min時兩者即有結(jié)合，隨著刺激時間的延長在lh，2h時兩者結(jié)合有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢，呈明顯的時間依賴性。(圖1)G川隊3(inPut)NFATINR訂l(inPut)臼臼夢勿娜鉚呀一匆盯一一~黔魏艇…一督一畜一{CD3/CD28刺激 Omin30minlh圖1:T細(xì)胞活化后，細(xì)胞中NFAI，1和GAI誘.3的動態(tài)相互作用(IP/wB條帶)2.FK一506對活化T細(xì)胞中NFATI和GATA3結(jié)合的影響免疫共沉淀方法(IP)檢測HUT-78在CD3/CD28雙信號通路刺激后細(xì)胞內(nèi)NFArl和GALA3結(jié)合及FK一506對兩者結(jié)合的影響。與eD3/eD28雙信號通路刺激組相比，F(xiàn)K一506(InM)組在3omin，lh，Zh時均能抑制N于，Al，l與GAI人3的結(jié)合

eD3/eD28雙信號通路刺激組相比，F(xiàn)K一506(InM)組在3omin，lh，Zh時均能抑制N于，Al，l與GAI人3的結(jié)合，2h時抑制明顯 (2.245士 0.093vs 1.181士0.091)，p<0.05。(圖2，圖3，表l)

制GATA3與工L一13啟動子的結(jié)合，這種抑制作用在 1h(3.952士0.262 VS2.819士0.444)及Zh(4.338士 1.42VS1.725士0.093)明顯，只 0.05。(圖4，圖5，圖6，表2)108+0D2 1.oe+001 1.De+DOD 1.0十D01 1.0B-0021，00一003 1.0令004 1.D任D05 1.0卜006 3579111315171921232527293133353739 CyeleNumber圖 4:FK·506干預(yù)后幾一13啟動子區(qū)域與GAI’A3結(jié)合片段的實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線 D.35 D.30 0.25 0.20 0.15 D.10D一05D一00一 0.05TemP俘rature(C).圖5:FK一506干預(yù)后IL一13啟動子區(qū)域與GALA3結(jié)合片段的實時熒光定量PCR融解曲線

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 殷凱生,姚欣,陳俊娣,黃茂,戴山林;在實驗動物中砷劑平喘機(jī)制的初步研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1999年05期

2 丁禮仁,沈華浩,崔巍;砷劑對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥的影響[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年11期

本文編號：2765122