發(fā)布時間：2020-07-21 20:51

【摘要】：杯狀細胞化生和黏液高分泌是哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性氣道炎性疾病的標志性特征。正常的黏液分泌是防止病原微生物和毒素攻擊的有效屏障，也是氣道先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。在慢性炎癥等病理狀態(tài)下，氣道黏液大量分泌，導致反復呼吸道感染和氣道阻塞。黏液高分泌引起的氣道阻塞是慢性氣道炎性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因，在慢性氣道炎性疾病進展的過程中，中性粒細胞彈性蛋白酶、活性氧簇和多種細胞因子會損傷氣道，導致黏蛋白大量合成和分泌。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20種不同的黏蛋白（mucin, MUC）基因，其中，氣道最主要的分泌型黏蛋白是MUC5AC，主要由杯狀細胞分泌�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC上調(diào)表達和杯狀細胞化生是氣道黏液高分泌的主要特征性表現(xiàn)。 支氣管哮喘是慢性氣道炎性疾病的代表，黏液高分泌是支氣管哮喘重要的病理特征，氣道黏液高分泌已經(jīng)成為影響哮喘病情和預后的獨立危險因素。在支氣管哮喘患者中，活化的Th2細胞分泌的細胞因子，可以直接激活肥大細胞， Th2型細胞因子主要包括白介素13(Interleukin-13,IL-13)、IL-9、IL-5和IL-4，其中IL-13和支氣管哮喘關系最為密切，也是目前研究最為深入的炎性因子。 在支氣管哮喘中，氧化和抗氧化的失衡是導致氣道黏液高分泌的另一個重要原因。IL-13刺激后細胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygenspecies, ROS）顯著上升，ROS能夠損傷細胞的大分子結(jié)構(gòu)例如DNAs，類脂和蛋白質(zhì)，從而導致氧化應激所誘導的組織損傷。氧化-抗氧化失衡可能是IL-13誘導黏液高分泌發(fā)生的重要機制，由于氧化應激在慢性氣道炎性疾病的發(fā)生發(fā)展中居重要地位，因此抗氧化是治療黏液高分泌的重要思路。 目的： 本研究在細胞模型中探討IL-13對MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和合成的影響，并探討相關的信號轉(zhuǎn)導機制。 從抗氧化的思路出發(fā)，選擇醛糖還原酶抑制劑作為干預因素，研究醛糖還原酶抑制劑對IL-13誘導的MUC5AC過度合成的影響及其分子機制。 方法： 在細胞模型中研究IL-13對MUC5AC轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的影響： 培養(yǎng)人氣道上皮細胞株(Human bronchial epithelial16, HBE16)，在IL-13刺激前予以無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24小時。實驗分為以下四組：對照組（加入PBS）、10nM IL-13組、25nM IL-13組、50nM IL-13組。通過四甲基偶氮唑鹽光吸收法{3-(4,5-dimethiylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT法}檢測IL-13刺激后細胞活性的變化；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（Retrovirus-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測IL-13刺激后MUC5AC mRNA表達的變化；酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測IL-13刺激后MUC5AC蛋白表達的變化。 在細胞模型中研究IL-13刺激黏液高分泌的信號轉(zhuǎn)導途徑 通過細胞模型研究IL-13刺激黏液高分泌的信號轉(zhuǎn)導機制。培養(yǎng)人氣道上皮細胞株HBE16細胞，在IL-13刺激前予以無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24小時。A771726用來特異性抑制信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子6(Signal Transducer and Activator of Transcription6, STAT6)的表達。通過RT-PCR檢測STAT4, STAT6, p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2） mRNA表達的變化，通過western blotting檢測STAT6, p38和ERK1/2蛋白表達的變化。通過凝膠阻滯實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA）檢測FOXA2（The forkhead box transcription factor A2,FOXA2)和激活蛋白1（Activation protein-1，AP-1）的DNA結(jié)合活性的變化。通過細胞免疫化學、激光共聚焦技術檢測IL-13刺激后跨膜蛋白16A（transmembrane protein16A, TMEM16A）和富含丙氨酸的豆蔻�；鞍准っ窩的作用底物(Myristoylated Alaninerich C Kinase Substrate,MARCKS)蛋白表達的變化。 抑制醛糖還原酶(Aldose reductase, AR）對IL-13誘導的黏液分泌的作用及其分子機制研究： 通過MTT方法檢測zopolrestat對HBE16細胞活力的影響。合成以往實驗驗證有效的醛糖還原酶siRNA干擾序列。HBE16細胞饑餓培養(yǎng)24小時后，加入zopolrestat或者AR siRNA，然后加入IL-13刺激24小時。通過RT-PCR或者ELISA檢測MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的變化。通過熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS生成的變化。通過westernblotting方法檢測AR、p-STAT6和激酶2（Janus Kinase2, JAK2）蛋白表達的變化。 結(jié)果： IL-13對MUC5AC轉(zhuǎn)錄和蛋白合成的影響： IL-13能夠減弱HBE16細胞的活力，對HBE16細胞活力的影響呈劑量依賴性。同對照組相比IL-13刺激后MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義，其效應呈劑量相關性（均P0.05）。 IL-13刺激黏液高分泌的信號轉(zhuǎn)導機制 通過RT-PCR和western blotting檢測IL-13刺激后細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的變化。和對照組相比，p-STAT6的表達顯著增高(P0.05)，而p-ERK1/2的表達沒有顯著變化(P0.05)。在加入STAT6特異性抑制劑A771726后，IL-13誘導的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成顯著降低(P0.05)。IL-13刺激后24-48小時能夠檢測到p38蛋白合成增加。IL-13刺激后FOXA2的DNA結(jié)合活性顯著降低，而AP-1的DNA結(jié)合活性沒有顯著變化(P0.05)。IL-13能夠顯著刺激細胞內(nèi)ROS合成增加(P0.05)，在48小時仍能持續(xù)刺激ROS生成。通過免疫熒光檢測IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS蛋白表達的變化，IL-13能夠顯著增加TMEM16A和MARCKS的蛋白表達(P0.05)。 醛糖還原酶抑制劑干預IL-13誘導的黏液分泌及其分子機制研究： Zopolrestat或者醛糖還原酶-小分子干擾RNA （AldoseReductase-Short interfering RNA，AR-siRNA)能夠顯著抑制IL-13誘導的MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。zopolrestat或者AR-siRNA能夠顯著減少IL-13誘導的ROS生成(P0.05)、抑制p-JAK2和p-STAT6的表達(P0.05)，從而減少黏液產(chǎn)物的生成。 結(jié)論： 1、IL-13能夠在細胞模型中顯著刺激MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，IL-13刺激黏液分泌的效應呈劑量相關性，隨著劑量增加，細胞活力也相應減弱。 2、IL-13刺激后STAT6的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成顯著增強，而ERK1/2的表達沒有顯著變化。IL-13刺激后FOXA2的DNA結(jié)合活性顯著降低，提示IL-13可能通過JAK2/STAT6-FOXA2通路刺激黏蛋白合成增加。 3、IL-13能夠通過P38/MAPK信號通路刺激黏蛋白合成增加，p38/MAPK信號通路需要依賴STAT6信號通路的激活。 4、IL-13刺激后TMEM16A和MARCKS表達顯著增加，IL-13可能通過TMEM16A和MARCKS調(diào)控黏蛋白的分泌。 5、IL-13刺激后細胞內(nèi)ROS生成顯著增加，氧化應激可能是IL-13引起黏液分泌的重要機制，抑制醛糖還原酶能夠減少IL-13誘導的ROS生成。 6、醛糖還原酶在慢性氣道炎性疾病黏液高分泌的發(fā)生中居重要地位，抑制醛糖還原酶能夠減少細胞內(nèi)ROS生成，抑制JAK/STAT信號通路，從而減少IL-13誘導的黏蛋白合成。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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1 劉劍波;張珍祥;徐永健;邢麗華;張惠蘭;;糖皮質(zhì)激素對IL-13誘導的小鼠肺組織黏蛋白基因Muc5ac表達的影響[J];中國免疫學雜志;2006年08期

2 陳萍;陳瑞珍;陳灝珠;;STAT蛋白在病毒性心肌炎中的抗病毒作用[J];中國免疫學雜志;2009年02期

3 江德鵬;Victor P.Kolosov;Juliy M.Perelman;周向東;;白介素13通過FOXA2調(diào)控氣道上皮細胞粘液分泌[J];中國免疫學雜志;2011年02期

本文編號：2764791