【摘要】： 肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病的終末階段,主要表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)成份(膠原和彈力纖維蛋白)破壞,終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端(包括呼吸細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊、肺泡)的過(guò)度充氣和擴(kuò)大。肺氣腫的發(fā)生發(fā)展與肺臟間質(zhì)蛋白降解破壞關(guān)系密切。肺臟間質(zhì)蛋白的降解酶主要包括纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)等。纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的含量及活性的改變影響肺氣腫的發(fā)生發(fā)展。 同肺間質(zhì)蛋白分解相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶主要包括MMP-2,MMP-9,MMP-12等。MMP-2和MMP-9主要降解基質(zhì)膠原蛋白;MMP-12主要降解基質(zhì)彈力纖維蛋白。抑制肺間質(zhì)蛋白分解的酶主要是基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1),通過(guò)與MMP-2,MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合,降低其活性,減少肺間質(zhì)破壞并促進(jìn)修復(fù)。 u-PA是絲氨酸蛋白酶蛋白酶家族中的重要成員之一,可作用于纖溶酶原和基質(zhì)金屬蛋白酶。u-PA與其受體uPAR結(jié)合,激活細(xì)胞周圍基質(zhì)中纖溶酶原(plasminogen,plg)轉(zhuǎn)交為纖溶酶(plasmin,plm),后者激活相應(yīng)G蛋白受體,發(fā)揮信號(hào)分子的作用。u-PA還可通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶原成為活性酶形式,降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白;在組織間質(zhì)損傷修復(fù)中也發(fā)揮重要作用。因此u-PA可能與肺氣腫的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。 在此,我們首次使用u-PA基因敲除小鼠研究u-PA對(duì)老年性肺氣腫樣改變的影響及其分子機(jī)制。通過(guò)提取15天(低齡組)及4月(高齡組)齡野生型小鼠和u-PA基因敲除小鼠肺組織進(jìn)行HE染色比較不同基因型小鼠肺組織形態(tài),結(jié)果顯示低齡組u-PA基因缺失小鼠相比野生型(WT)小鼠肺組織形態(tài)無(wú)明顯差異,高齡組野生型小鼠肺泡擴(kuò)大,肺間質(zhì)破壞明顯。相比之下,u-PA基因缺失小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)較完整,肺泡腔無(wú)明顯增大。為進(jìn)一步分析產(chǎn)生上述差異的原因,我們應(yīng)用圖像分析軟件image pro plus v5.0結(jié)合weigert彈力纖維蛋白染色,對(duì)肺間質(zhì)彈力纖維等肺組織成份進(jìn)行半定量分析(weigert彈力纖維染色陽(yáng)性部分占總高倍視野面積蛋白),結(jié)果顯示高齡組u-PA基因缺失小鼠肺彈力纖維含量顯著高于野生型小鼠(P＜0.05),低齡組兩者無(wú)顯著差異。Real-time PCR檢測(cè)彈力蛋白(Elastin),MMP-12和TIMP-1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示高齡組u-PA基因缺失小鼠肺組織Elastin和TIMP-1的mRNA表達(dá)顯著高于野生型小鼠(P＜0.01),同時(shí)MMP-12的mRNA也略有升高,低齡組無(wú)顯著差異。 以上結(jié)果說(shuō)明,u-PA基因缺失減輕了小鼠實(shí)驗(yàn)性老年性肺氣腫樣改變,分析其分子機(jī)制可能是u-PA基因缺失后,導(dǎo)致彈力蛋白和TIMP-1基因的表達(dá)升高,肺組織彈力纖維含量增加所致。 肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病的終末階段,主要表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)成份包括膠原和彈力纖維蛋白的破壞,終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端(包括呼吸細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊、肺泡)的過(guò)度充氣和擴(kuò)大。肺臟間質(zhì)蛋白的降解酶主要包括纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)等。其中MMP-2和MMP-9主要降解基質(zhì)膠原蛋白,MMP-12主要降解基質(zhì)彈力纖維蛋白�；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑—1(TIMP-1)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族最重要的抑制劑,同MMP-2,MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合,降低其酶活性,減少肺間質(zhì)破壞并促進(jìn)修復(fù)。 纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是目前所發(fā)現(xiàn)的纖溶酶原激活物(tissue plasmingen activator,t-PA;urokinase typeplasminogen activator,u-PA)抑制物中作用最強(qiáng)的蛋白質(zhì)分子。由于uPA,tPA能夠激活基質(zhì)金屬蛋白從酶原形式變?yōu)榛钚孕问?后者是膠原及彈性蛋白等基質(zhì)蛋白的主要降解酶類。因此,PAI-1可能參與了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的代謝并在老年性肺氣腫中發(fā)揮了一定的作用。 我們首次使用PAI-1基因敲除小鼠研究PAI-1在老年性肺氣腫發(fā)生發(fā)展中的作用。通過(guò)肺組織病理學(xué)切片(組織HE染色)分析,比較1天、3月、6月齡PAI-1基因敲除小鼠與野生型小鼠在肺臟結(jié)構(gòu)差異,結(jié)果顯示PAI-1基因缺失小鼠高齡組肺間質(zhì)破壞明顯,肺泡腔擴(kuò)大:為進(jìn)一步分析產(chǎn)生上述差異的原因,我們應(yīng)用羥脯氨酸含量測(cè)定分析肺組織膠原蛋白含量,結(jié)果顯示PAI-1基因缺失雖引起肺間質(zhì)破壞,但膠原含量高于野生型小鼠;weigert彈力纖維染色結(jié)合image pro plusv5.0圖象分析軟件半定量分析肺臟彈力纖維蛋白含量,顯示PAI-1基因缺失導(dǎo)致肺彈力纖維蛋白含量降低,且隨鼠齡增加,彈力纖維減少量增加,彈力纖維空間結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重;我們通過(guò)明膠酶譜試驗(yàn),western blot檢測(cè)主要的膠原降解酶MMP-2、MMP-9和彈力纖維降解酶MMP-12的蛋白含量,結(jié)果顯示PAI-1基因缺失小鼠MMP-2、MMP-9活性較野生型小鼠低,而MMP-12蛋白含量升高明顯;免疫組化、免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證明PAI-1基因缺失可引起肺間質(zhì)MMP-12蛋白分泌量的增加;real-time PCR試驗(yàn)分析膠原、彈力纖維、基質(zhì)金屬蛋白酶(包括MMP-12、MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—1(TGF-β1)的相對(duì)mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示PAI-1基因缺失可引起MMP-12mRNA表達(dá)升高,高齡組小鼠同時(shí)具有較高的彈力纖維mRNA表達(dá)。 我們認(rèn)為,PAI-1基因缺失促進(jìn)MMP-12表達(dá)水平的升高,MMP-12蛋白分泌的增加導(dǎo)致小鼠肺彈力纖維降解,造成小鼠肺組織空間結(jié)構(gòu)完整性的破壞。高齡小鼠肺組織內(nèi)彈力纖維及TIMP-1基因表達(dá)水平升高可能是一種代償性的改變,此改變未能完全代償PAI-1缺失導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)破壞。PAI-1基因在肺臟空間結(jié)構(gòu)完整性的保護(hù)方面發(fā)揮著重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R563.3
【圖文】：

試驗(yàn)結(jié)果織級(jí)片彩殺學(xué)天鼠齡的野生型小鼠肺組織切片隴染色(圖IA)同u一PA基因敲除IB)相比，肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)無(wú)明顯差異;Weigert彈力纖維彈力纖維le、n)及加ageproplusv5.0軟件分析(圖3)證實(shí)兩種基因型小鼠中彈力纖維含量在肺組織中的比例相近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4月齡WT織切片現(xiàn)染色(圖ZA)同u一PA基因敲除小鼠(圖ZB)相比，野生泡壁有明顯的破壞，肺泡直徑增大。Weigert彈力纖維彈力纖維染色也證實(shí)野生型小鼠肺間質(zhì)中彈力纖維結(jié)構(gòu)較u一PA基因敲除小鼠(圖ZD重。軟件分析結(jié)果(圖3)證明彈力纖維的組織含量野生型小鼠為(255)%，明顯少于u一PA基因敲除小鼠(34.70士2.12)%(p<0.05)。

圖24月齡小鼠肺組織切片HE、Weigert彈力纖維染色Fig24thmontholdmieelungseetionswithHEandWeigertstain圖A:4月齡野生型小鼠肺組織切片HE染色(放大X200)

碩_l.論文第一部分1116660.3612220.3248880.2442220.3738881117770.3482220.3761110.229990.326444lll8880.3543330.3412220.2314440.352222lll9990.3345550.3396660.2593330.324999222OOO0.3438880.3577770.2345550.331888XXXXX0.011977770.018663330.013471110.02118777AAAverageee0.3475550.352055550.251425550.34708555

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本文編號(hào)：2763875