【摘要】：第一部分羅格列酮對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷肺泡上皮細胞的作用研究目的:羅格列酮是一種過氧物酶體激活物受體γ(PPARγ)激動劑,本研究旨在探究羅格列酮對急性肺損傷中肺泡上皮細胞中的保護機制。方法:本研究分對照組、脂多糖(LPS)組和LPS+羅格列酮干預(yù)組。采用10umol/L的羅格列酮處理LPS刺激的A549細胞,通過CCK-8試驗檢測比較LPS以及羅格列酮干預(yù)對A549細胞活力的影響;通過流式細胞檢測并比較LPS以及羅格列酮處理對A549細胞凋亡以及活性氧(ROS)水平的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測LPS和羅格列酮處理A549細胞培養(yǎng)上清中α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)以及單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的水平。采用實時熒光定量PCR(real-timePCR)以及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測PPARγ,NF-κBp65、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。結(jié)果:(1)采用l0ug/mlLPS處理A549細胞24、48和72小時,對A549細胞活力的抑制作用可分別達到12.03%,28.83%和41.50%。采用l0ug/mlLPS和10 umol/L羅格列酮處理A549細胞24、48和72小時,與單純LPS處理組相比,A549 細胞活力分別增加 5.39%(p0.05)、17.27%(p0.01)和 24.39%(p0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;(2)與對照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細胞48小時能夠顯著誘導(dǎo)細胞凋亡(7.62倍)。采用10ug/mlLPS和10umol/L羅格列酮處理A549細胞48小時,與單純LPS處理組相比,A549細胞凋亡率減低58.22%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(3)與對照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細胞48小時能夠明顯增加細胞內(nèi)活性氧ROS的水平(1.73倍);采用10ug/ml LPS和10umo1/L羅格列酮處理A549細胞48小時,與單純LPS處理組相比,A549細胞內(nèi)活性氧ROS的水平顯著降低45.63%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(4)與對照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細胞,48小時后檢測出A549細胞后TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分別增加2.55、1.89以及1.25倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理A549細胞48小時,與單純LPS處理組相比,A549細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分別降低35.38%、30.76%和28.18%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(5)與對照組相比,采用1Oug/ml LPS處理A549細胞48小時,能夠顯著增加NOX4和iNOS的mRNA表達水平4.82和2.66倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理A549細胞48小時,與單純LPS處理組相比,A549細胞NOX4和iNOS的mRNA表達水平分別降低62.25%和57.86%。LPS和羅格列酮處理A549細胞后細胞中NOX4和iNOS的蛋白表達水平也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。并且,與對照組相比,采用10 ug/ml LPS處理A549細胞48小時,能夠分別降低PPARy和Bcl-2的蛋白表達水平44.63%、52.23%,同時NF-κBp65和Bax的蛋白表達水平分別上升1.03和6.36倍。采用10ug/mlLPS和10umol/L羅格列酮處理A549細胞48小時,與單純LPS處理組相比,A549細胞PPAy以及Bcl-2的蛋白表達水平分別顯著上升2.21和0.46倍,而NF-κBp65和Bax的蛋白表達水平分別降低29.63%和51.43%,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:LPS能夠抑制肺上皮細胞系A(chǔ)549細胞增殖、促進細胞凋亡、降低活性氧ROS水平以及包括TNF-α,IL-6和MCP-1在內(nèi)的炎癥細胞因子的產(chǎn)生。羅格列酮能夠明顯促進LPS刺激的A549細胞的增殖、降低細胞凋亡級細胞內(nèi)活性氧ROS水平以及炎癥反應(yīng)。羅格列酮能夠抑制NF-κB信號通路的激活,降低Bax/Bcl-2的表達比例。羅格列酮能夠通過促進肺上皮細胞系A(chǔ)549細胞PPARγ的表達以減弱LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡以及炎癥反應(yīng),抑制NF-κB信號通路的激活。羅格列酮可作為治療急性肺損傷的潛在治療藥物。第二部分羅格列酮對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的作用研究目的:羅格列酮是一種過氧物酶體激活受體γ(PPARγ)激動劑,本研究旨在探究羅格列酮是否能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。方法:本研究分對照組、LPS組和LPS+羅格列酮干預(yù)組。采用1Oumo1/L的羅格列酮處理脂多糖(LPS)刺激的HUVECs,通過MTT法試驗檢測比較LPS以及羅格列酮干預(yù)不同時間段對HUVECs活力的影響;通過流式細胞術(shù)檢測比較LPS和羅格列酮處理對HUVECs凋亡以及ROS水平的影響;LPS以及羅格列酮處理后48小時促炎細胞因子TNF-α,IL-6,趨化因子CXCL12以及趨化因子受體CXCR4的水平分別通過ELISA、real-time PCR和western blot進行檢測;通過real-time PCR和western blot檢測LPS以及羅格列酮處理后48小時PPARγ,JAK2/STAT3、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。結(jié)果:(1)采用10ug/ml LPS處理HUVECs細胞24、48和72小時能夠分別抑制細胞活力15.7%、31.2%和49.3%。采用1Oug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理HUVECs24、48和72小時能夠分別增加HUVECs的活力4.7%(p0.05)、22.7%(p0.01)和 44.1%(p0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;(2)采用 1Oug/mlLPS處理HUVECs48小時能夠顯著增加HUVECs的細胞凋亡率7.4倍,而10umol/L羅格列酮處理能夠減少62.2%的LPS引起的細胞凋亡。采用1Oug/ml LPS處理HUVECs48小時能夠增加HUVECs的ROS水平3.5倍;同時用10umol/L羅格列酮處理能夠抑制LPS引起的ROS水平45.9%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(3)TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平在 LPS 處理的 HUVECs 中分別上調(diào)2.5、1.9、1.5以及1.8倍。而10umol/L羅格列酮處理能夠減少LPS干預(yù)的 HUVECs 上清液中的 TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平 34.9%、27.0%、40.1%和41.6%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(4)采用10ug/ml LPS處理HUVECs細胞48小時能夠增加p-JAK2和p-STAT3的水平4.9和2.8倍。而10umol/L羅格列酮處干預(yù)后能夠分別減少LPS處理的HUVECs中p-JAK2和p-STAT3的水平34.2%和38.9%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);(5)采用10ug/ml LPS處理HUVECs48小時能夠顯著減低PPARy和Bcl-2的水平43.8%和55.1%,增加Bax水平4.3倍。而10umol/L羅格列酮處理能夠分別增加PPARy和Bcl-2的水平1.4及0.45倍,降低Bax的水平40.4%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:羅格列酮能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的人HUVECs的活力下降、細胞凋亡、活性氧ROS水平以及炎癥反應(yīng)。LPS能夠明顯增加HUVECs中JAK2/STAT3信號通路的活性以及Bax/Bcl-2的比例,而羅格列酮處理能夠使其明顯降低。在體外,PPARy參與急性肺損傷的病理過程。進一步探究急性呼吸窘迫綜合征的分子機制對于未來開發(fā)新型ALI/ARDS的治療藥物至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563
【圖文】：

３．１羅格列酮對ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細胞活力的影響逡逑與對照組相比，采用１０邋Ｈｇ／ｍｌＬＰＳ分別處理的人肺泡上皮Ａ５４９細胞２４、４８、逡逑７２小時后，Ａ５４９細胞的增殖活力分別下降１２＿０３％、２８．８３％以及４１．５０％邋（圖１）。逡逑而采用１０邋ｐｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ羅格列酮分別處理２４、４８、７２小時后，與逡逑單純ＬＰＳ處理組相比，Ａ５４９細胞的增殖活力分別上升５．３９％、１７．２７％以及２４．３９％。逡逑我們懫用１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０叫ｏｌ／Ｌ羅格列酮處理４８小時進行后續(xù)試驗。逡逑２９逡逑

３．２羅格列酮對ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細胞凋亡的影響逡逑與對照組相比，１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ處理４８小時能夠顯著誘導(dǎo)Ａ５４９細胞的細胞凋逡逑亡，其凋亡細胞比例是對照組的７．２倍（圖２Ａ，圖２Ｂ）。而采用１０ｐｇ／ｍｌＬＰＳ逡逑以及１０邋｜ｉＭ羅格列酮處理４８小時后，與單純ＬＰＳ處理組相比，Ａ５４９細胞的細逡逑胞凋亡顯著下降５８．２２％。逡逑３０逡逑

３．３羅格列酮對ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細胞活性氧ＲＯＳ水平的影響逡逑與對照組相比，１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ處理４８小時能夠顯著誘導(dǎo)Ａ５４９細胞逡逑細胞內(nèi)活性氧ＲＯＳ的水平，其ＲＯＳ水平是對照組的１．７３倍（圖３）。而懫用逡逑１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ羅格列酮處理４８小時后，與單純ＬＰＳ處理逡逑組相比，Ａ５４９細胞的細胞ＲＯＳ顯著下降４５．６３％。逡逑３１逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Teayoun Kim;Qinglin Yang;;Peroxisome-proliferator-activated receptors regulate redox signaling in the cardiovascular system[J];World Journal of Cardiology;2013年06期

2 李莎;高玉潔;蔣衛(wèi)清;鮑紅光;;羅格列酮對膿毒癥小鼠轉(zhuǎn)歸的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2010年22期

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本文編號：2759258