發(fā)布時(shí)間：2020-07-17 09:19

【摘要】：第一部分羅格列酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷肺泡上皮細(xì)胞的作用研究目的:羅格列酮是一種過氧物酶體激活物受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑,本研究旨在探究羅格列酮對(duì)急性肺損傷中肺泡上皮細(xì)胞中的保護(hù)機(jī)制。方法:本研究分對(duì)照組、脂多糖(LPS)組和LPS+羅格列酮干預(yù)組。采用10umol/L的羅格列酮處理LPS刺激的A549細(xì)胞,通過CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)比較LPS以及羅格列酮干預(yù)對(duì)A549細(xì)胞活力的影響;通過流式細(xì)胞檢測(cè)并比較LPS以及羅格列酮處理對(duì)A549細(xì)胞凋亡以及活性氧(ROS)水平的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)LPS和羅格列酮處理A549細(xì)胞培養(yǎng)上清中α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR)以及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)PPARγ,NF-κBp65、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。結(jié)果:(1)采用l0ug/mlLPS處理A549細(xì)胞24、48和72小時(shí),對(duì)A549細(xì)胞活力的抑制作用可分別達(dá)到12.03%,28.83%和41.50%。采用l0ug/mlLPS和10 umol/L羅格列酮處理A549細(xì)胞24、48和72小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549 細(xì)胞活力分別增加 5.39%(p0.05)、17.27%(p0.01)和 24.39%(p0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)與對(duì)照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細(xì)胞48小時(shí)能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(7.62倍)。采用10ug/mlLPS和10umol/L羅格列酮處理A549細(xì)胞48小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549細(xì)胞凋亡率減低58.22%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(3)與對(duì)照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細(xì)胞48小時(shí)能夠明顯增加細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的水平(1.73倍);采用10ug/ml LPS和10umo1/L羅格列酮處理A549細(xì)胞48小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的水平顯著降低45.63%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(4)與對(duì)照組相比,采用10ug/mlLPS處理A549細(xì)胞,48小時(shí)后檢測(cè)出A549細(xì)胞后TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分別增加2.55、1.89以及1.25倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理A549細(xì)胞48小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α,IL-6和MCP-1的水平分別降低35.38%、30.76%和28.18%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(5)與對(duì)照組相比,采用1Oug/ml LPS處理A549細(xì)胞48小時(shí),能夠顯著增加NOX4和iNOS的mRNA表達(dá)水平4.82和2.66倍。采用10ug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理A549細(xì)胞48小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549細(xì)胞NOX4和iNOS的mRNA表達(dá)水平分別降低62.25%和57.86%。LPS和羅格列酮處理A549細(xì)胞后細(xì)胞中NOX4和iNOS的蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。并且,與對(duì)照組相比,采用10 ug/ml LPS處理A549細(xì)胞48小時(shí),能夠分別降低PPARy和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平44.63%、52.23%,同時(shí)NF-κBp65和Bax的蛋白表達(dá)水平分別上升1.03和6.36倍。采用10ug/mlLPS和10umol/L羅格列酮處理A549細(xì)胞48小時(shí),與單純LPS處理組相比,A549細(xì)胞PPAy以及Bcl-2的蛋白表達(dá)水平分別顯著上升2.21和0.46倍,而NF-κBp65和Bax的蛋白表達(dá)水平分別降低29.63%和51.43%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:LPS能夠抑制肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低活性氧ROS水平以及包括TNF-α,IL-6和MCP-1在內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。羅格列酮能夠明顯促進(jìn)LPS刺激的A549細(xì)胞的增殖、降低細(xì)胞凋亡級(jí)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平以及炎癥反應(yīng)。羅格列酮能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活,降低Bax/Bcl-2的表達(dá)比例。羅格列酮能夠通過促進(jìn)肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞PPARγ的表達(dá)以減弱LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng),抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。羅格列酮可作為治療急性肺損傷的潛在治療藥物。第二部分羅格列酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究目的:羅格列酮是一種過氧物酶體激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑,本研究旨在探究羅格列酮是否能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。方法:本研究分對(duì)照組、LPS組和LPS+羅格列酮干預(yù)組。采用1Oumo1/L的羅格列酮處理脂多糖(LPS)刺激的HUVECs,通過MTT法試驗(yàn)檢測(cè)比較LPS以及羅格列酮干預(yù)不同時(shí)間段對(duì)HUVECs活力的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較LPS和羅格列酮處理對(duì)HUVECs凋亡以及ROS水平的影響;LPS以及羅格列酮處理后48小時(shí)促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-6,趨化因子CXCL12以及趨化因子受體CXCR4的水平分別通過ELISA、real-time PCR和western blot進(jìn)行檢測(cè);通過real-time PCR和western blot檢測(cè)LPS以及羅格列酮處理后48小時(shí)PPARγ,JAK2/STAT3、Bax、Bcl-2、NOX4 和 iNOS 的 mRNA 水平以及蛋白水平。結(jié)果:(1)采用10ug/ml LPS處理HUVECs細(xì)胞24、48和72小時(shí)能夠分別抑制細(xì)胞活力15.7%、31.2%和49.3%。采用1Oug/ml LPS和10umol/L羅格列酮處理HUVECs24、48和72小時(shí)能夠分別增加HUVECs的活力4.7%(p0.05)、22.7%(p0.01)和 44.1%(p0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(2)采用 1Oug/mlLPS處理HUVECs48小時(shí)能夠顯著增加HUVECs的細(xì)胞凋亡率7.4倍,而10umol/L羅格列酮處理能夠減少62.2%的LPS引起的細(xì)胞凋亡。采用1Oug/ml LPS處理HUVECs48小時(shí)能夠增加HUVECs的ROS水平3.5倍;同時(shí)用10umol/L羅格列酮處理能夠抑制LPS引起的ROS水平45.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(3)TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平在 LPS 處理的 HUVECs 中分別上調(diào)2.5、1.9、1.5以及1.8倍。而10umol/L羅格列酮處理能夠減少LPS干預(yù)的 HUVECs 上清液中的 TNF-α,IL-6,CXCL12 以及 CXCR4 的水平 34.9%、27.0%、40.1%和41.6%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(4)采用10ug/ml LPS處理HUVECs細(xì)胞48小時(shí)能夠增加p-JAK2和p-STAT3的水平4.9和2.8倍。而10umol/L羅格列酮處干預(yù)后能夠分別減少LPS處理的HUVECs中p-JAK2和p-STAT3的水平34.2%和38.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);(5)采用10ug/ml LPS處理HUVECs48小時(shí)能夠顯著減低PPARy和Bcl-2的水平43.8%和55.1%,增加Bax水平4.3倍。而10umol/L羅格列酮處理能夠分別增加PPARy和Bcl-2的水平1.4及0.45倍,降低Bax的水平40.4%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:羅格列酮能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的人HUVECs的活力下降、細(xì)胞凋亡、活性氧ROS水平以及炎癥反應(yīng)。LPS能夠明顯增加HUVECs中JAK2/STAT3信號(hào)通路的活性以及Bax/Bcl-2的比例,而羅格列酮處理能夠使其明顯降低。在體外,PPARy參與急性肺損傷的病理過程。進(jìn)一步探究急性呼吸窘迫綜合征的分子機(jī)制對(duì)于未來(lái)開發(fā)新型ALI/ARDS的治療藥物至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563
【圖文】：

３．１羅格列酮對(duì)ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細(xì)胞活力的影響逡逑與對(duì)照組相比，采用１０邋Ｈｇ／ｍｌＬＰＳ分別處理的人肺泡上皮Ａ５４９細(xì)胞２４、４８、逡逑７２小時(shí)后，Ａ５４９細(xì)胞的增殖活力分別下降１２＿０３％、２８．８３％以及４１．５０％邋（圖１）。逡逑而采用１０邋ｐｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ羅格列酮分別處理２４、４８、７２小時(shí)后，與逡逑單純ＬＰＳ處理組相比，Ａ５４９細(xì)胞的增殖活力分別上升５．３９％、１７．２７％以及２４．３９％。逡逑我們懫用１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ以及１０叫ｏｌ／Ｌ羅格列酮處理４８小時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。逡逑２９逡逑

３．２羅格列酮對(duì)ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細(xì)胞凋亡的影響逡逑與對(duì)照組相比，１０邋＾ｇ／ｍｌＬＰＳ處理４８小時(shí)能夠顯著誘導(dǎo)Ａ５４９細(xì)胞的細(xì)胞凋逡逑亡，其凋亡細(xì)胞比例是對(duì)照組的７．２倍（圖２Ａ，圖２Ｂ）。而采用１０ｐｇ／ｍｌＬＰＳ逡逑以及１０邋｜ｉＭ羅格列酮處理４８小時(shí)后，與單純ＬＰＳ處理組相比，Ａ５４９細(xì)胞的細(xì)逡逑胞凋亡顯著下降５８．２２％。逡逑３０逡逑

３．３羅格列酮對(duì)ＬＰＳ處理的人肺泡上皮Ａ５４９細(xì)胞活性氧ＲＯＳ水平的影響逡逑與對(duì)照組相比，１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ處理４８小時(shí)能夠顯著誘導(dǎo)Ａ５４９細(xì)胞逡逑細(xì)胞內(nèi)活性氧ＲＯＳ的水平，其ＲＯＳ水平是對(duì)照組的１．７３倍（圖３）。而懫用逡逑１０邋ｐｇ／ｍｌ脂多糖ＬＰＳ以及１０邋ｐｍｏｌ／Ｌ羅格列酮處理４８小時(shí)后，與單純ＬＰＳ處理逡逑組相比，Ａ５４９細(xì)胞的細(xì)胞ＲＯＳ顯著下降４５．６３％。逡逑３１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Teayoun Kim;Qinglin Yang;;Peroxisome-proliferator-activated receptors regulate redox signaling in the cardiovascular system[J];World Journal of Cardiology;2013年06期

2 李莎;高玉潔;蔣衛(wèi)清;鮑紅光;;羅格列酮對(duì)膿毒癥小鼠轉(zhuǎn)歸的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年22期

3 ;Upregulation of PTEN involved in rosiglitazone-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年06期

本文編號(hào)：2759258