【摘要】： 本實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建BCK1基因miRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染體外提純培養(yǎng)卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC),通過(guò)觀(guān)察其包囊增殖情況,電鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染后PC超微機(jī)構(gòu)變化以及RT-PCR觀(guān)察BCK1基因受干擾情況,初步探討RNA干擾技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)PC的抑制效果。 方法:連續(xù)地塞米松皮下注射正常wistar大鼠6W,誘導(dǎo)卡氏肺孢子肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia PCP)動(dòng)物模型;依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,結(jié)合PC BCK1基因序列特征,借助生物學(xué)信息學(xué)軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)兩對(duì)靶向PC BCK1基因的siRNA。應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建BCK1基因短發(fā)價(jià)狀siRNA質(zhì)粒干擾載體。提純并體外培養(yǎng)PC細(xì)胞,利用脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染入PC細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組、未經(jīng)任何處理空白陰性對(duì)照組。根據(jù)每日熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光個(gè)數(shù),選用最優(yōu)轉(zhuǎn)染方法;采用GMS染色,計(jì)數(shù)每日包囊數(shù)變化情況,根據(jù)每隔1d PC包囊計(jì)數(shù)情況,對(duì)不同組別,觀(guān)察d數(shù)及重復(fù)次數(shù)等各因素進(jìn)行多因素方差分析,使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS計(jì)算出F值。作用72h后掃描電鏡觀(guān)察空白組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PC蟲(chóng)體超微結(jié)構(gòu)變化情況,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PC BCK1基因表達(dá)變化情況。 結(jié)果:成功建立卡氏肺孢子肺炎大鼠模型,成功構(gòu)建2種BCK1siRNA真核表達(dá)載體,命名為BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2。轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)PC經(jīng)GMS染色并計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)BCK1 siRNA能夠影響體外培養(yǎng)PC包囊的增殖,與空白對(duì)照組相比,BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2對(duì)PC增殖抑制率分別為35.4%和42.5%。通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察可見(jiàn)siRNA真核表達(dá)載體組PC超微機(jī)構(gòu)出現(xiàn)不同程度細(xì)胞壁破損等改變。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCK1基因mRNA表達(dá)發(fā)生抑制,BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2對(duì)PC mRNA表達(dá)的抑制率分別為57.38%和64.45%。 結(jié)論:BCK1 siRNA真核表達(dá)載體能通過(guò)有效干擾PC BCK1基因的復(fù)制和表達(dá),并影響體外培養(yǎng)PC細(xì)胞的增殖,能夠?qū)C細(xì)胞壁產(chǎn)生一定破壞作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R563.1
【圖文】：

輕柔混勻，室溫放置 5min將兩者混合， 孔板中，每個(gè)比例組轉(zhuǎn)染 8 孔。分別在轉(zhuǎn)（放大 600 倍）觀(guān)察熒光個(gè)數(shù)，每孔數(shù) 數(shù)均數(shù)，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 進(jìn)行多因-shRNA1 和 BCK1-shRNA2 雙酶切后凝RⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pPC-MSG后產(chǎn)生28酶切后產(chǎn)生 2800bp 與 325bp 片斷，凝膠1-shRNA1 和 BCK1-shRNA2 已被插入到1 2 3 4bp

BCK1-shRNA2 測(cè)序結(jié)果圖 2 重組質(zhì)粒 BCK1-shRNA1，BCK1-shRNA2 測(cè)序結(jié)果Fig2 The DNA sequence of BCK1-shRNA1，BCK1-shRNA23.3 PCP 動(dòng)物模型建立注射地塞米松六周后，動(dòng)物出現(xiàn)食欲下降，毛色變暗，毛發(fā)脫落，呼吸加快，少動(dòng)。此時(shí)剖殺大鼠，并作肺葉橫斷印片，GMS 染色可見(jiàn)大量卡氏肺孢子包囊。見(jiàn)圖 33.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化按質(zhì)粒與 Lipofectamin 按不同比例轉(zhuǎn)染 PC 后分別在 24h，48h，72h 倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察每視野熒光個(gè)數(shù)，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間其轉(zhuǎn)染效率見(jiàn)表 1，結(jié)果表明：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 24h、48h、72h 比較，轉(zhuǎn)染 48h 轉(zhuǎn)染效率高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.5）。質(zhì)粒與脂質(zhì)體質(zhì)量體積比各組比較，當(dāng)比例為 1:2 時(shí)，即質(zhì)粒 2μg

圖 3 GFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 PC 24h 后熒光表達(dá)情況（×600）Fig 3 PC transfected with GFP recombinant plasmid after 24h圖 3 GFP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 PC48h 后熒光表達(dá)情況（×600）Fig 3 PC transfected with GFP recombinant plasmid after 48h

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本文編號(hào)：2753182