發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 02:20

【摘要】：支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)及細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、氣道阻塞、氣道炎癥和氣道重構(gòu)。臨床上以反復(fù)發(fā)作的咳嗽、胸悶和呼吸困難為主要表現(xiàn),可自愈或經(jīng)藥物緩解。 遺傳流行病學(xué)研究表明支氣管哮喘是遺傳和環(huán)境因素共同作用而引起的復(fù)雜疾病。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多染色體區(qū)域與哮喘或哮喘相關(guān)表型連鎖,并在這些連鎖區(qū)域內(nèi)確定了多個(gè)哮喘易感基因。5q31-33是一個(gè)重要的哮喘易感基因候選區(qū)域,已經(jīng)在多個(gè)人群中得到證實(shí),人類TIM基因家族即位于這一區(qū)域而且是利用小鼠模型通過定位克隆分離到的哮喘易感基因。 支氣管哮喘作為一種多基因遺傳的免疫相關(guān)疾病,以Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)為主要特征,存在向Th2細(xì)胞的免疫偏離。功能上與Th1/Th2細(xì)胞誘導(dǎo)及分化相關(guān)的基因可能通過影響Th1/Th2細(xì)胞的誘導(dǎo)與分化引發(fā)或者促進(jìn)Th1/Th2平衡失調(diào)從而在哮喘發(fā)生中起作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)人類TIM基因家族成員可能參與CD4+T細(xì)胞的分化與增殖,是一類可能影響Th1/Th2平衡的哮喘候選基因。 人類TIM基因家族包括三個(gè)成員TIM-1,TIM-3和TIM-4,編碼一類T細(xì)胞表面具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白。自TIM基因家族發(fā)現(xiàn)以來,對該基因家族成員在哮喘發(fā)生中的作用及其與哮喘的相關(guān)性研究成為熱點(diǎn)。TIM-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TIM家族成員,它選擇性的表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表面,并持續(xù)優(yōu)先在Th2細(xì)胞表達(dá)�？梢奣IM-1的表達(dá)在哮喘的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用。但是目前對TIM-1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制知之甚少,TIM-1基因多態(tài)性在中國漢族人群哮喘發(fā)生中的作用也不明確。為此,本課題我們進(jìn)行了以下兩方面的研究： 第一部分人TIM-1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究 人類TIM-1基因的基因組DNA全長約29kb,其mRNA有兩種轉(zhuǎn)錄本,分別包含8個(gè)和9個(gè)外顯子。人TIM-1分子主要在人T細(xì)胞、肝臟和腎臟中表達(dá),在脾臟和胸腺中也有少量的表達(dá),而在心臟和肺中不表達(dá)。TIM-1基因的表達(dá)能夠引起包括哮喘在內(nèi)的一些免疫性疾病的發(fā)生。 為明確TIM-1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,本課題首先采用MatInspector軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫提供的人類TIM-1基因翻譯起始點(diǎn)上游約2Kb序列進(jìn)行分析,篩選潛在的順式作用元件。根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)引物,利用不含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的報(bào)告基因分析系統(tǒng)pGL3-basic載體,將人類TIM-1基因編碼序列上游2 Kb范圍內(nèi)的系列截短片段分別克隆到pGL3-basic載體報(bào)告基因上游,通過構(gòu)建一系列含人類TIM-1基因上游序列的熒光素酶表達(dá)載體,,以檢測這些片段的啟動(dòng)子活性。并進(jìn)一步構(gòu)建了三種點(diǎn)突變熒光素酶表達(dá)載體,即分別突變E2F4核心序列的TIM1-E2F4- Mut、突變Spl核心序列的TIM1-Sp1-Mut以及突變GFI1核心序列的TIM1-GFI1-Mut載體。以PRL-TK為內(nèi)參照質(zhì)粒(pRL-TK質(zhì)粒含有海腎熒光素酶報(bào)告基因,用來校正轉(zhuǎn)染效率),利用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000,將構(gòu)建的表達(dá)載體以及陰性對照pGL3-basic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Chang Liver和293T細(xì)胞株,24h后收集細(xì)胞,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)定量分析啟動(dòng)子活性；并采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)進(jìn)一步明確鑒定的順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用。取得了如下結(jié)果： 第一、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系列截短載體的結(jié)果顯示,TIM-1基因的表達(dá)活性有三個(gè)較大的落差,分別位于在-98bp至-28bp之間、-28bp至-9bp之間和+422bp至+458bp的三個(gè)區(qū)域,表明這三個(gè)區(qū)域內(nèi)存在人類TIM-1基因的主要表達(dá)調(diào)控元件。MatInspector軟件分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)區(qū)域內(nèi)分別含有重要的表達(dá)調(diào)控元件E2F4、Spl和GFIl結(jié)合元件。 第二,為證實(shí)E2F4、Spl和GFI1結(jié)合位點(diǎn)的作用,我們采用PCR的方法將三個(gè)結(jié)合元件的核心序列做了突變,構(gòu)建了突變型表達(dá)載體。對比分析野生型和突變型表達(dá)載體熒光素酶表達(dá)活性發(fā)現(xiàn),突變結(jié)合位點(diǎn)核心序列可導(dǎo)致表達(dá)載體熒光素酶表達(dá)活性顯著降低,突變載體的轉(zhuǎn)錄活性接近不含結(jié)合位點(diǎn)的載體活性。證實(shí)這三個(gè)位點(diǎn)是人類TIM-1基因基本啟動(dòng)子功能所必需的； 第三,為進(jìn)一步證實(shí)E2F4、Spl和GFI1在人類TIM-1基因基本啟動(dòng)子活性中的作用,我們采用EMSA方法,在體外檢測了E2F4、Spl和GFI1與DNA的結(jié)合情況。結(jié)果顯示標(biāo)記的野生型探針能特異結(jié)合核蛋白形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,非標(biāo)記野生型探針能有效競爭復(fù)合物的形成,而非標(biāo)記突變型探針無明顯競爭作用。證明該區(qū)域的E2F4、Spl和GFI1結(jié)合位點(diǎn)能與細(xì)胞內(nèi)E2F4、Spl和GFI1蛋白特異結(jié)合。 綜上所述,本課題通過缺失和點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn)調(diào)控人類TIM-1基因基本啟動(dòng)子活性的順式作用元件是位于-98bp至-28bp之間的E2F4、位于-28bp至-9bp之間的Spl結(jié)合位點(diǎn)和位于+422bp至+458bp之間的GFI1結(jié)合位點(diǎn),EMSA分析證實(shí)這三個(gè)位點(diǎn)能特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。這三個(gè)順式調(diào)控元件是人類TIM-1基本啟動(dòng)子活性所必需的。 第二部分TIM-1基因多態(tài)性與中國漢族人群哮喘的相關(guān)性研究 如前所述,無論是TIM-1所在位置還是其表達(dá)模式和功能都提示該基因可能在哮喘發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作中,通過對TIM-1基因內(nèi)部的三個(gè)SNP及TIM-1基因上游調(diào)控區(qū)域的兩個(gè)SNP的研究發(fā)現(xiàn),位于TIM-1基因上游調(diào)控區(qū)域的一個(gè)功能性SNP與漢族人群哮喘存在相關(guān)性。 為鑒定TIM-1基因內(nèi)導(dǎo)致哮喘易感的功能位點(diǎn),,我們在TIM-1基因內(nèi)選擇了rs4235719、rs1553318、rs953568、rs1039438和rs6878732等5個(gè)SNP,其中rs4235719為位于基因上游調(diào)控區(qū)域的SNP；rs1553318和rs953568均為位于基因第四內(nèi)含子的SNP;rs6878732和rs1039438是根據(jù)HapMap中HCB的數(shù)據(jù)得出標(biāo)簽SNP,各自代表著一個(gè)不同的連鎖不平衡板塊。利用病例-對照研究方法分析這五個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)與中國漢族人群哮喘之間的相關(guān)性。 收集中國漢族哮喘患者及正常對照個(gè)體外周血,提取基因組DNA。收集的哮喘患者均符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn),共569例；正常對照個(gè)體均無哮喘及其它過敏性疾病癥狀與病史,排除肝、腎疾病等,共578例。用PCR-RFLP的方法對TIM-1基因的SNP位點(diǎn)分型。針對沒有合適酶切位點(diǎn)的SNP,通過PIRA-PCR的手段,利用錯(cuò)配引物引入合適的酶切位點(diǎn)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定個(gè)體基因型,并計(jì)算各位點(diǎn)在哮喘組和對照組中的基因型頻率及等位基因頻率。 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計(jì)算各多態(tài)位點(diǎn)在哮喘組和對照組的預(yù)期基因型頻率,采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,五個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率分布在患者組與對照組均符合Hardy-Weinberg平衡。采用卡方檢驗(yàn)比較各多態(tài)位點(diǎn)在哮喘組與對照組的基因型與等位基因頻率差異,檢驗(yàn)多態(tài)位點(diǎn)與哮喘的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)： 1.TIM-1基因rs4235719、rs1553318、rs953568、rs1039438及rs6878732五個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在中國漢族人群中具有多態(tài)性。這五個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在哮喘組與對照組之間無顯著性差異,提示它們與中國漢族人群哮喘無相關(guān)性,但不排除TIM-1基因其它多態(tài)位點(diǎn)可能與中國漢族人群哮喘相關(guān),還需要對另外的一些位點(diǎn)進(jìn)行功能分析來鑒定它們在哮喘發(fā)生中的作用。 2.對實(shí)驗(yàn)室前期研究的五個(gè)SNP位點(diǎn)在擴(kuò)大的樣本中進(jìn)行分型,分型數(shù)據(jù)與前期研究數(shù)據(jù)綜合。分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)多態(tài)位點(diǎn)rs41297579、rs6149307、rs45439103和rs34670839與中國漢族人群哮喘發(fā)生無顯著相關(guān),而rs9313422位點(diǎn)與中國漢族人群哮喘相關(guān)(P=0.0004)。 3.利用SHEsis軟件對TIM-1基因十個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行單體型構(gòu)建,得到的3種單體型中,單體型hapl和hap3的頻率在哮喘組與對照組間有顯著性差異,攜帶單體型hap3增加哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR：2.001,95%CI：1.492-2.686)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;SHEsis,a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium,haplotype construction,and genetic association at polymorphism loci[J];Cell Research;2005年02期

2 崔天盆,金晶,劉昌玉,巫學(xué)蘭,吳健民,胡麗華;湖北漢族兒童TIM1基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘關(guān)系的研究[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2004年04期

本文編號(hào)：2745956