【摘要】：目的機(jī)械通氣是呼吸衰竭患者不可缺少的生命支持手段,也是手術(shù)患者常用的呼吸管理方法,而機(jī)械通氣性肺損傷(ventilator induced lung injury, VILI)是機(jī)械通氣的常見并發(fā)癥,影響機(jī)械通氣的治療效果。盡管肺保護(hù)通氣策略(小潮氣量機(jī)械通氣)能減少VILI的發(fā)生,但為了保證足夠的氣體交換潮氣量的減少常常受到限制,因此尋求VILI有效的藥物預(yù)防仍有重要意義。VILI的主要病理基礎(chǔ)是肺泡炎癥及肺泡毛細(xì)血管通透性增加,但具體機(jī)制還不清楚。因此,本研究擬觀察SD大鼠VILI過程中肺泡炎癥反應(yīng)、整合素αVβ3、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性,以及人工合成RGDS肽(非特異性整合素受體阻斷劑)對(duì)機(jī)械通氣導(dǎo)致的αVβ3、NF-κB活性變化的影響,以期闡明整合素αVβ3介導(dǎo)的NF-κB通路在肺泡炎癥中的作用。同時(shí),建立人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular,HPMVEC)的機(jī)械牽拉模型,觀察機(jī)械牽拉對(duì)HPMVEC單層通透性及整合素αVβ3活性的影響,并分析兩者的關(guān)系,以期闡明整合素αVβ3在肺泡毛細(xì)血管通透性中的作用。從而最終明確整合素αVβ3在VILI中的作用及相關(guān)機(jī)制,為VILI的防治尋求新的靶點(diǎn)。 方法 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):21只雄性SD(Sprague Dawley)成年大鼠隨機(jī)分為3組(n=7):對(duì)照組(Control組),大潮氣量機(jī)械通氣組(H_(VT)組);RGDS肽預(yù)處理組(H_(VT)+RGDS組)。各組大鼠麻醉后氣管切開插管,Control組大鼠自主呼吸4 h;H_(VT)組大鼠行機(jī)械通氣,潮氣量35 ml/kg,呼吸頻率50次/min;H_(VT)+RGDS組在機(jī)械通氣前30 min給予整合素受體阻斷劑RGDS肽5 mg/kg腹腔注射,機(jī)械通氣參數(shù)設(shè)定同H_(VT)組。機(jī)械通氣4 h后放血處死大鼠,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage ?uid,BALF)和肺組織。BALF經(jīng)離心分別收集上清和沉淀,用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)檢測(cè)上清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的濃度,用BAC( bicinchoninic acid)蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中總蛋白的濃度;BALF沉淀用于有核細(xì)胞計(jì)數(shù),并通過細(xì)胞涂片的瑞氏染色對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行分類。左肺組織行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察肺組織病理變化;右肺組織提取總蛋白并用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法測(cè)定整合素αVβ3、NF-κB抑制蛋白(I-κB)的表達(dá)以及其磷酸化水平。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):購買HPMVEC細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)傳代,4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組:對(duì)照組(Control組);機(jī)械牽拉組(Stretch組);ML9預(yù)處理組(Stretch+ML9組)。Control組細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)在培養(yǎng)箱內(nèi),不給予機(jī)械牽拉;Stretch組細(xì)胞給予機(jī)械牽拉刺激2 h;Stretch+ML9組細(xì)胞于機(jī)械牽拉前給予肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML9預(yù)處理(50μM,2 h)。用磁扭力刺激(magnetic twisting stimulation, MTS)對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)施機(jī)械牽拉。用Transwell模型及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖苷(fluorescrin isothiocyanate marked dextran, FITC-dextran)溶液檢測(cè)單層細(xì)胞通透性,右旋糖苷通過單層內(nèi)皮細(xì)胞的多少代表單層細(xì)胞通透性,用光密度(optical density, OD)表示;用磁扭力細(xì)胞儀(magnetic twisting cytometry, MTC)檢測(cè)細(xì)胞間拉力;用免疫熒光染色檢測(cè)整合素αVβ3和肌動(dòng)蛋白的分布;用Western Blot方法檢測(cè)整合素αVβ3的表達(dá)。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA),P值小于0.05為差異有顯著性。 結(jié)果 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)Control組大鼠無明顯的病理改變,而H_(VT)組肺組織病理變化明顯,包括炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡水腫以及肺泡結(jié)構(gòu)破壞,而H_(VT)+RGDS組的肺組織病理變化較H_(VT)組明顯減輕;(2)與Control組比較,H_(VT)組支氣管肺泡灌洗液中多核細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量和總蛋白濃度明顯增高;與H_(VT)組比較,H_(VT)+RGDS組支氣管肺泡灌洗液中多核細(xì)胞、單核細(xì)胞及總蛋白明顯減少(P0.05);(3)與Control組比較,H_(VT)組支氣管肺泡灌洗液中IL-6,TNF-α濃度明顯增加;與H_(VT)組比較,H_(VT)+RGDS組支氣管肺泡灌洗液中IL-6,TNF-α濃度明顯減少(P0.05);(4)與Control組比較,H_(VT)組肺組織整合素αVβ3、I-κB磷酸化明顯增加;與H_(VT)組比較,H_(VT)+RGDS組肺組織整合素αVβ3、I-κB磷酸化明顯減少(P0.05)。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)與Control組比較,Stretch組的通透性明顯增加(P0.05),而Stretch+ML9組通透性無明顯變化;(2)Control組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白主要分布在細(xì)胞周邊,而Stretch組細(xì)胞漿內(nèi)可見明顯的應(yīng)力纖維形成,Stretch+ML9組肌動(dòng)蛋白的分布與Control組相似(;3)Control組細(xì)胞整合素αVβ3均勻分布在細(xì)胞表面;而Stretch組細(xì)胞的整合素αVβ3明顯簇積;Stretch+ML9組細(xì)胞整合素αVβ3的分布與Control組相似;(4)與Control組比較,Stretch組細(xì)胞間拉力明顯增加(P0.05),而Stretch+ML9組無明顯改變。 結(jié)論(1)整合素αVβ3活化參與VILI的炎癥反應(yīng)及毛細(xì)血管通透性增加;(2)整合素αVβ3介導(dǎo)的NF-κB活化是VILI炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一;(3)整合素αVβ3簇積及應(yīng)力纖維形成導(dǎo)致的細(xì)胞間拉力增加是VILI毛細(xì)血管通透性增加的可能機(jī)制; (4)抑制整合素活性可望成為VILI新的防治手段。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R563.8
【圖文】：

圖 4 肺組織病理切片（HE, ×120, n=7） SD 大鼠保持自主呼吸（Control 組）、大潮氣量機(jī)械通氣（HVT組）或于機(jī)械通氣前 30 min 腹腔注射 RGDS 肽（5 mg/kg）（HVT＋RGDS 組），并于機(jī)械通氣 4 h 后收集肺組織行 HE 染色觀察肺泡結(jié)構(gòu)的病理變化。Control 組肺組織無明顯的病理變化；HVT組肺泡炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡充血；HVT＋RGD組肺泡內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整。Figure 4 Histology of lung tissues of SD rats (HE staining, magnification 120 times, n=7Rats were kept spontaneous respiration (Control group), exposed to mechanical ventilatiowith high tidal volume (HVTgroup), and pretreated with RGDS (5 mg/kg, i.p.) 30 min beformechanical ventilation (HVT＋RGDS group). Lung tissues were obtained after 4 h mechanicaventilation. There were no significant phathological changes in Control group; significaninfiltration of inflammatory cells, extensive thickening of the alveolar wall, demolishestructure of pulmonary alveoli, and hemorrhage were observed in HVTgroup; a littlinfiltration of inflammatory cells, mild thickening of some alveolar wall were observed in H

泡灌洗液中細(xì)胞因子水平(n=7) SD 大鼠保持自主呼吸（ContrHVT組）或于機(jī)械通氣前 30 min 腹腔注射 RGDS 肽（5 mg/kg）通氣 4 h 后收集 BALF。HVT組 BALF 中 TNF-α 和 IL-6 水平明 預(yù)處理可明顯抑制促炎細(xì)胞因子的增多。ATNF-α 水平；B IL-表示。與 Control 組比較，*▲P<0.05；與 HVT組比較，#P<0.05。 TNF-αand IL-6 levels in BALF (n=7). Rats were kept spontanp), exposed to mechanical ventilation with high tidal volume (Hith RGDS (5 mg/kg, i.p.) 30 min before mechanical ventilatio was obtained after 4 h mechanical ventilation. The levels of T were significantly increased compared with Control group. Preedly inhibited mechanical ventilaiton-induced increase of TNF-n BALF. (B) IL-6 level in BALF. Results are expressed as mean ± #

織整合素 αVβ3 的表達(dá)與活化（n＝7） SD 大鼠保持自主呼吸（Contro通氣（HVT組）或于機(jī)械通氣前 30 min 腹腔注射 RGDS 肽（5 mg/kg）（H機(jī)械通氣 4 h 后收集肺組織提取總蛋白，用 Western Blot 檢測(cè)整合素 β3β-actin 作為蛋白上樣的自身對(duì)照。A 整合素 β3 和磷酸化 β3 的表達(dá)；B β3 對(duì) β-actin 的相對(duì)光密度。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。與 Control 組比較比較，#P<0.05。The expression of integrin αVβ3 and its activation in the lung tissues (n=7)taneous respiration (Control group), exposed to mechanical ventilationme (HVTgroup), and pretreated with RGDS (5 mg/kg, i.p.) 30 min beforen (HVT＋RGDS group). Lung tissues were obtained after 4 h mechanical xtracts were prepared for western blotting analysis. Integrin β3 and phosn β3 in lung tissues were detected by Western blotting; β-actin was used a Expression of integrin β3 and phosphated β3. B The optical density of

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本文編號(hào)：2743568