【摘要】：隨著環(huán)境和生活方式的改變,支氣管哮喘發(fā)病率逐年增加,而以流感為代表的病毒感染引起的非過(guò)敏性哮喘也逐漸增多,且常規(guī)的皮質(zhì)類藥物對(duì)此療效甚微,因此亟需研究病毒感染等引起的非過(guò)敏性哮喘發(fā)病過(guò)程,尋找潛在治療方法。同時(shí),流感作為多發(fā)的呼吸道疾病,在全球范圍內(nèi)危害較大,目前用于治療流感的藥物主要為神經(jīng)氨酸酶抑制劑和基質(zhì)蛋白2 (Matrix protein 2, M2)離子通道阻斷劑,但兩類藥物均存在耐藥性逐漸增強(qiáng)和毒副作用等缺點(diǎn),因此迫切需要研發(fā)和評(píng)價(jià)新型高效抗流感藥物。本論文由兩部分研究組成。第一部分通過(guò)建立H1N1亞型流感病毒誘導(dǎo)小鼠哮喘氣道高反應(yīng)(Airway Hyper-reactivity, AHR)模型,尋找潛在的治療非過(guò)敏性哮喘的有效方法。首先將HlN1亞型流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (PR8)以1.5×103EID5o劑量滴鼻接種小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠肺臟內(nèi)病毒在3dpi達(dá)到高峰,約為107EID50/g；呼吸道癥狀明顯,組織病理學(xué)變化顯著；小鼠血清抗體顯著上升;且在5dpi時(shí)經(jīng)乙酰甲膽堿刺激后肺阻力(lung resistance, RL)值可達(dá)到基礎(chǔ)值的325%,形成典型的氣道高反應(yīng)(Airway Hyper-reactivity, AHR)癥狀,與公認(rèn)的過(guò)敏性卵清蛋白(Ovalbumin)哮喘氣道高反應(yīng)相似。同樣劑量感染Rag2-/-基因敲除小鼠,在感染5天后,Rag2"/-基因敲除小鼠也出現(xiàn)典型的AHR癥狀。同時(shí)發(fā)現(xiàn),支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BAFL) IL-5和IL-13水平顯著升高。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PR8感染Rag24-小鼠后,肺臟ILC2陽(yáng)性細(xì)胞比例為13.4%,顯著高于對(duì)照組,小鼠肺臟中的ST2 mRNA水平上升3倍,其配體IL-33水平亦顯著上升。將重組IL-33蛋白滴鼻給予未感染流感病毒小鼠,結(jié)果表明均可形成明顯的氣道高反應(yīng)；應(yīng)用IL-33單克隆抗體腹腔注射于AHR模型小鼠,感染流感病毒后動(dòng)物未出現(xiàn)典型AHR癥狀。結(jié)果表明IL-33是流感病毒誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)過(guò)程的重要因子之一,其單克隆抗體可以作為治療氣道高反應(yīng)的潛在藥物。第二部分研究是在體外藥物篩選模型基礎(chǔ)上,利用流感小鼠感染模型進(jìn)行體內(nèi)篩選。首先,運(yùn)用蛋白重組技術(shù)建立體外抗流感藥物篩選模型,將金剛烷胺類藥物敏感毒株A/Aichi/2/68(Aichi)M2基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,重組細(xì)菌加入IPTG同時(shí)加入終濃度70uM的鹽酸金剛烷胺,11h后OD600值為0.47,未加入藥物處理組的OD600值小于0.2,結(jié)果表明成功建立敏感型M2離子通道體外篩選模型。對(duì)7種候選抗流感藥物以終濃度70uM加入體外篩選模型,結(jié)果表明其中3種藥物A21、A189和A193具有體外抗流感病毒能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證候選藥物A21、A189和A193體內(nèi)抗流感效力,用10LD50的流感病毒Aichi株建立體內(nèi)篩選模型。結(jié)果表明,候選藥物A193以100mg/kg/d劑量給藥可以顯著提高小鼠存活率;以50 mg/kg/d和10mg/kg/d劑量給藥,可使動(dòng)物模型存活率分別達(dá)到100%和80%。七種候選藥物在體內(nèi)、外均未表現(xiàn)出抵抗耐藥性流感病毒的能力。結(jié)果表明,候選藥物A193是潛在的M2離子通道抑制劑。綜上所述,本論文建立了流感病毒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生氣道高反應(yīng)模型,并運(yùn)用該模型發(fā)現(xiàn)了IL-33是流感病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生氣道高反應(yīng)的關(guān)鍵因子,且IL-33單克隆抗體對(duì)小鼠哮喘AHR癥狀具有緩解或治療效果;建立了流感病毒M2蛋白離子通道融合表達(dá)細(xì)菌模型,并對(duì)候選藥物進(jìn)行了初步篩選;在體外試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用小鼠體內(nèi)藥物篩選模型,發(fā)現(xiàn)了1種具有潛在抑制金剛烷胺類藥物敏感型毒株的藥物,為將來(lái)進(jìn)一步研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R562.25;R-332


本文編號(hào)：2743552