【摘要】： 支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1-3]。Th2細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng),Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[3-5]。目前研究發(fā)現(xiàn),“Th1/Th2偏移”假說(shuō)不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)機(jī)制異常[6-10],近年又提出了“免疫耐受缺陷”的假說(shuō)。正常人接觸過(guò)敏原后不會(huì)發(fā)生Th2細(xì)胞的過(guò)度活化,這是因?yàn)檎Ｈ丝梢詫?duì)過(guò)敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過(guò)敏原后T細(xì)胞異�；罨�,增殖和分化為Th2細(xì)胞,引起“Th1/Th2偏移”,始動(dòng)哮喘的氣道炎癥�！懊庖吣褪苋毕荨钡募僬f(shuō)從更深的層次解釋了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)異常,可能是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。 過(guò)敏原特異性免疫治療(SIT)是目前已知唯一針對(duì)哮喘病因的治療方法,它在一定程度上可以改善這種免疫耐受的缺陷,但其作用機(jī)制目前尚不完全清楚[11-12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),成功的SIT,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的誘導(dǎo)產(chǎn)生起重要作用[11-15]。哮喘體內(nèi)Tregs功能的異常和分化數(shù)量的減少,在哮喘的變應(yīng)性氣道炎癥中起重要作用[16-19]。調(diào)控Tregs的具體機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β、Notch信號(hào)均與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)[20-23]。既往研究顯示大劑量過(guò)敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性[24]。大劑量過(guò)敏原是通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞不反應(yīng)性目前尚不清楚。為此,本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度OVA對(duì)致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的作用,以及大劑量OVA體外處理分別對(duì)IL-10和TGF-β分泌的作用,對(duì)DC表面共刺激信號(hào)表達(dá)的作用、對(duì)Tregs極化的作用、對(duì)T-bet和GATA3表達(dá)以及Notch信號(hào)表達(dá)的作用,以研究其誘導(dǎo)T細(xì)胞不反應(yīng)性的具體機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容和方法: 1.復(fù)制致敏小鼠模型,并分離培養(yǎng)致敏及正常對(duì)照小鼠脾臟DC和T細(xì)胞。 2.不同濃度的OVA體外處理致敏和正常對(duì)照小鼠脾臟DC和T細(xì)胞,ELISA檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌情況,不同濃度的過(guò)敏原體外處理致敏和正常對(duì)照小鼠脾臟DC,ELISA檢測(cè)IL-10,TGF-β1的分泌水平,并分析與Th1/Th2因子的相關(guān)性。 3.流式檢測(cè)致敏及正常對(duì)照小鼠脾臟DC表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達(dá)。致敏小鼠脾臟DC與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,流式檢測(cè)并比較CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)。 4.分離小鼠CD4+T細(xì)胞,流式檢測(cè)致敏小鼠和正常對(duì)照小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量。致敏小鼠脾臟DC、CD4+T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,流式檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量。 5. RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)致敏小鼠和正常對(duì)照小鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達(dá)水平。致敏小鼠脾臟DC、CD4+T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達(dá)。 6. RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)致敏小鼠和正常對(duì)照小鼠DC和T細(xì)胞Notch配體和受體的mRNA及蛋白表達(dá)水平。致敏小鼠脾臟DC、T細(xì)胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)Jagged1和Notch3表達(dá)。 7.分離培養(yǎng)小鼠骨髓DC,流式檢測(cè)表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達(dá)。 8.應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將Notch配體Jagged1轉(zhuǎn)染小鼠骨髓DC。RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染DC中目的基因表達(dá)狀況。 9. Jagged1轉(zhuǎn)染DC與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC分別與致敏小鼠CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后,流式檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果: 1.在0~1mg/ml濃度范圍內(nèi),致敏小鼠Th2細(xì)胞因子的分泌隨處理濃度增高而增高,但在10mg/ml的OVA作用下,IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的分泌水平則較其他組明顯降低(p0.05)。IL-2和IFN-γ的分泌也受到明顯抑制(p0.05)。而對(duì)正常對(duì)照小鼠T細(xì)胞,OVA濃度的變化對(duì)其Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌無(wú)影響。 2.在0~10mg/ml濃度范圍內(nèi),致敏小鼠分泌IL-10,TGF-β1水平隨處理濃度增高而增高,正常對(duì)照小鼠各濃度處理組之間無(wú)顯著差異。致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子水平與IL-10和TGF-β1水平無(wú)明顯相關(guān)性。 3.致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCII表達(dá)顯著高于正常對(duì)照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)明顯降低。 4.致敏小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對(duì)照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量顯著上升。 5.致敏小鼠T細(xì)胞T-bet的mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照小鼠顯著降低,而GATA-3的表達(dá)較正常對(duì)照小鼠顯著升高。大劑量過(guò)敏原(10mg/ml的OVA)作用下致敏小鼠T細(xì)胞T-bet的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低,GATA-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低。 6.致敏小鼠脾DC Notch配體Jagged1、Jagged2以及Delta1 mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照小鼠顯著降低,而Delta3、Delta4 mRNA的表達(dá)則與正常對(duì)照小鼠相比無(wú)顯著差異。致敏小鼠T細(xì)胞Notch受體Notch1、Notch3 mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照小鼠顯著降低,而Notch2, Notch4 mRNA的表達(dá)則與正常對(duì)照小鼠相比無(wú)顯著差異。大劑量過(guò)敏原(10mg/ml的OVA)體外處理后致敏小鼠DC Jagged1和T細(xì)胞Notch3的mRNA表達(dá)均較對(duì)照組顯著增加。 7.致敏小鼠脾臟DC Jagged1蛋白表達(dá)及T細(xì)胞Notch3蛋白表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照小鼠。大劑量OVA體外處理后Jagged1及Notch3蛋白表達(dá)水平顯著上升。 8. RT-PCR半定量法及Western Blotting證實(shí)Jagged1轉(zhuǎn)染骨髓DC內(nèi)有轉(zhuǎn)染基因mRNA及蛋白表達(dá)。 9.致敏小鼠CD4+T細(xì)胞經(jīng)Jagged1轉(zhuǎn)染DC處理后,CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多。 結(jié)論: 1.大劑量過(guò)敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細(xì)胞的不反應(yīng)性,其機(jī)制與降低致敏小鼠DC共刺激分子表達(dá),誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化等有關(guān)。 2.致敏小鼠DC/T細(xì)胞Notch信號(hào)配體/受體表達(dá)有明顯的降低。大劑量過(guò)敏原在體外作用可上調(diào)其表達(dá)。Jagged1轉(zhuǎn)染DC能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化。以上提示Notch信號(hào)途徑的“缺陷”可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞極化不足的重要原因。 本文的結(jié)果證明,大劑量過(guò)敏原可以恢復(fù)變應(yīng)原致敏T細(xì)胞的免疫耐受,給特異性過(guò)敏原免疫治療提供了充實(shí)的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R562.25
【圖文】：

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾臟 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表達(dá)分別由 35.46+6.76％、67.83+5.72％減少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（圖3 及圖 4）。

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾臟 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表達(dá)分別由 35.46+6.76％、67.83+5.72％減少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（圖3 及圖 4）。圖 1 小鼠脾臟 DC 的 CD11c 表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 孫鯤,王長(zhǎng)征;不同濃度過(guò)敏原對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-5的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年16期

2 夏俊波,吳奎,孫鯤,王長(zhǎng)征;小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增與鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年10期

3 吳奎,孫鯤,畢玉田,夏俊波,王長(zhǎng)征;哮喘小鼠CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及功能的改變[J];中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2005年06期

4 孫鯤;林科雄;吳奎;王長(zhǎng)征;;CD_4~+ CD_(25)~+T淋巴細(xì)胞對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響及作用機(jī)制[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年02期

本文編號(hào)：2735649