【摘要】： 支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種炎癥細胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病,其發(fā)病機制尚未完全闡明[1-3]。Th2細胞的過度活化導(dǎo)致了Th2反應(yīng)為主的免疫反應(yīng),Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等分泌增多在哮喘的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[3-5]。目前研究發(fā)現(xiàn),“Th1/Th2偏移”假說不能完全解釋哮喘的免疫學(xué)機制異常[6-10],近年又提出了“免疫耐受缺陷”的假說。正常人接觸過敏原后不會發(fā)生Th2細胞的過度活化,這是因為正常人可以對過敏原產(chǎn)生免疫耐受。而哮喘患者由于免疫耐受缺陷導(dǎo)致接觸過敏原后T細胞異�；罨�,增殖和分化為Th2細胞,引起“Th1/Th2偏移”,始動哮喘的氣道炎癥�！懊庖吣褪苋毕荨钡募僬f從更深的層次解釋了哮喘發(fā)病的免疫學(xué)異常,可能是哮喘發(fā)病的重要機制。 過敏原特異性免疫治療(SIT)是目前已知唯一針對哮喘病因的治療方法,它在一定程度上可以改善這種免疫耐受的缺陷,但其作用機制目前尚不完全清楚[11-12]。近年來研究發(fā)現(xiàn),成功的SIT,調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的誘導(dǎo)產(chǎn)生起重要作用[11-15]。哮喘體內(nèi)Tregs功能的異常和分化數(shù)量的減少,在哮喘的變應(yīng)性氣道炎癥中起重要作用[16-19]。調(diào)控Tregs的具體機制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),抑制性細胞因子IL-10和TGF-β、Notch信號均與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞的產(chǎn)生有關(guān)[20-23]。既往研究顯示大劑量過敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細胞不反應(yīng)性[24]。大劑量過敏原是通過何種機制誘導(dǎo)致敏小鼠T細胞不反應(yīng)性目前尚不清楚。為此,本實驗觀察了不同濃度OVA對致敏小鼠Th1/Th2細胞因子分泌的作用,以及大劑量OVA體外處理分別對IL-10和TGF-β分泌的作用,對DC表面共刺激信號表達的作用、對Tregs極化的作用、對T-bet和GATA3表達以及Notch信號表達的作用,以研究其誘導(dǎo)T細胞不反應(yīng)性的具體機制。 研究內(nèi)容和方法: 1.復(fù)制致敏小鼠模型,并分離培養(yǎng)致敏及正常對照小鼠脾臟DC和T細胞。 2.不同濃度的OVA體外處理致敏和正常對照小鼠脾臟DC和T細胞,ELISA檢測Th1/Th2細胞因子的分泌情況,不同濃度的過敏原體外處理致敏和正常對照小鼠脾臟DC,ELISA檢測IL-10,TGF-β1的分泌水平,并分析與Th1/Th2因子的相關(guān)性。 3.流式檢測致敏及正常對照小鼠脾臟DC表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達。致敏小鼠脾臟DC與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,流式檢測并比較CD80、CD86等共刺激分子的表達。 4.分離小鼠CD4+T細胞,流式檢測致敏小鼠和正常對照小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數(shù)量。致敏小鼠脾臟DC、CD4+T細胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,流式檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞的數(shù)量。 5. RT-PCR和Western blotting法分別檢測致敏小鼠和正常對照小鼠T細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達水平。致敏小鼠脾臟DC、CD4+T細胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,RT-PCR和Western blotting法分別檢測T-bet和GATA3的mRNA及蛋白表達。 6. RT-PCR和Western blotting法分別檢測致敏小鼠和正常對照小鼠DC和T細胞Notch配體和受體的mRNA及蛋白表達水平。致敏小鼠脾臟DC、T細胞與10mg/ml OVA或生理鹽水共培養(yǎng)后,RT-PCR和Western blotting法分別檢測Jagged1和Notch3表達。 7.分離培養(yǎng)小鼠骨髓DC,流式檢測表面分子CD11c、MHCII、CD80、CD86表達。 8.應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將Notch配體Jagged1轉(zhuǎn)染小鼠骨髓DC。RT-PCR和Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染DC中目的基因表達狀況。 9. Jagged1轉(zhuǎn)染DC與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC分別與致敏小鼠CD4+T細胞共培養(yǎng)后,流式檢測CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量。 結(jié)果: 1.在0~1mg/ml濃度范圍內(nèi),致敏小鼠Th2細胞因子的分泌隨處理濃度增高而增高,但在10mg/ml的OVA作用下,IL-4、IL-5等細胞因子的分泌水平則較其他組明顯降低(p0.05)。IL-2和IFN-γ的分泌也受到明顯抑制(p0.05)。而對正常對照小鼠T細胞,OVA濃度的變化對其Th1/Th2細胞因子的分泌無影響。 2.在0~10mg/ml濃度范圍內(nèi),致敏小鼠分泌IL-10,TGF-β1水平隨處理濃度增高而增高,正常對照小鼠各濃度處理組之間無顯著差異。致敏小鼠Th1/Th2細胞因子水平與IL-10和TGF-β1水平無明顯相關(guān)性。 3.致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCII表達顯著高于正常對照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾臟DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達明顯降低。 4.致敏小鼠脾臟細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量顯著低于正常對照小鼠。10mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量顯著上升。 5.致敏小鼠T細胞T-bet的mRNA及蛋白表達較正常對照小鼠顯著降低,而GATA-3的表達較正常對照小鼠顯著升高。大劑量過敏原(10mg/ml的OVA)作用下致敏小鼠T細胞T-bet的mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低,GATA-3的mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低。 6.致敏小鼠脾DC Notch配體Jagged1、Jagged2以及Delta1 mRNA的表達較正常對照小鼠顯著降低,而Delta3、Delta4 mRNA的表達則與正常對照小鼠相比無顯著差異。致敏小鼠T細胞Notch受體Notch1、Notch3 mRNA的表達較正常對照小鼠顯著降低,而Notch2, Notch4 mRNA的表達則與正常對照小鼠相比無顯著差異。大劑量過敏原(10mg/ml的OVA)體外處理后致敏小鼠DC Jagged1和T細胞Notch3的mRNA表達均較對照組顯著增加。 7.致敏小鼠脾臟DC Jagged1蛋白表達及T細胞Notch3蛋白表達均顯著低于正常對照小鼠。大劑量OVA體外處理后Jagged1及Notch3蛋白表達水平顯著上升。 8. RT-PCR半定量法及Western Blotting證實Jagged1轉(zhuǎn)染骨髓DC內(nèi)有轉(zhuǎn)染基因mRNA及蛋白表達。 9.致敏小鼠CD4+T細胞經(jīng)Jagged1轉(zhuǎn)染DC處理后,CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量增多。 結(jié)論: 1.大劑量過敏原在體外可誘導(dǎo)致敏小鼠T細胞的不反應(yīng)性,其機制與降低致敏小鼠DC共刺激分子表達,誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞極化等有關(guān)。 2.致敏小鼠DC/T細胞Notch信號配體/受體表達有明顯的降低。大劑量過敏原在體外作用可上調(diào)其表達。Jagged1轉(zhuǎn)染DC能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞極化。以上提示Notch信號途徑的“缺陷”可能是調(diào)節(jié)性T細胞極化不足的重要原因。 本文的結(jié)果證明,大劑量過敏原可以恢復(fù)變應(yīng)原致敏T細胞的免疫耐受,給特異性過敏原免疫治療提供了充實的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R562.25
【圖文】：

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾臟 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表達分別由 35.46+6.76％、67.83+5.72％減少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（圖3 及圖 4）。

10mg/ml 的 OVA 作用后，致敏小鼠脾臟 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86 的表達分別由 35.46+6.76％、67.83+5.72％減少至 21.94+5.00％、44.36+3.44％（p<0.05）（圖3 及圖 4）。圖 1 小鼠脾臟 DC 的 CD11c 表達

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 孫鯤,王長征;不同濃度過敏原對哮喘小鼠T淋巴細胞產(chǎn)生IL-5的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年16期

2 夏俊波,吳奎,孫鯤,王長征;小鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外擴增與鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年10期

3 吳奎,孫鯤,畢玉田,夏俊波,王長征;哮喘小鼠CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量及功能的改變[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2005年06期

4 孫鯤;林科雄;吳奎;王長征;;CD_4~+ CD_(25)~+T淋巴細胞對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響及作用機制[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2006年02期

本文編號：2735649