【摘要】：目的:探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-細(xì)胞分裂周期蛋白(mTOR-Cdc42)信號通路在PM2.5加劇慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(AM)吞噬功能障礙中的作用及機(jī)制。方法:將50只SPF級雄性8周齡BALB/c小鼠,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照(A)組、慢阻肺(B)組、PM2.5慢阻肺(C)組、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)慢阻肺(D)組、EGCG+PM2.5慢阻肺(E)組,每組10只。采用單純香煙煙霧持續(xù)暴露90d建立慢阻肺小鼠模型。采集蘭州市城關(guān)區(qū)大氣中的PM2.5,C組和E組給予PM2.5(720?g/m3)持續(xù)霧化吸入90d,A組、B組和D組給予同等體積的生理鹽水霧化吸入。采用不連續(xù)密度梯度離心法分離小鼠AM,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/ml,D組和E組EGCG終濃度為40μmol/L,孵育24h。采用小鼠無創(chuàng)體描箱檢測肺功能,處死小鼠,取左肺下葉,行病理學(xué)檢查。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AM吞噬異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大腸桿菌(FITC-E.coli)的能力。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法(WB)檢測mRNA及蛋白的表達(dá)。采用小G蛋白活性檢測(G-LISA)試劑盒檢測Cdc42的活性。采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架。結(jié)果:(1)慢阻肺模型的肺功能及肺組織病理學(xué)改變:B組吸氣峰流速(PIF)、呼氣峰流速(PEF)和呼出50%潮氣量時的流速(EF50)(7.5±1.0、4.67±0.6、3.29±0.43)顯著低于A組(11.61±1.12、7.63±0.44、5.05±0.37)(均P0.01);C組(4.96±0.91、3.34±0.48、2.14±0.29)顯著低于B組(均P0.01)。C組小鼠肺組織中可見明顯的支氣管炎癥和肺氣腫改變,較B組程度嚴(yán)重,A組小鼠肺組織無此病理改變。(2)AM的吞噬功能:B組平均熒光強(qiáng)度(MFI)和吞噬FITC-E.coli陽性細(xì)胞百分比(吞噬%)(4060±590、28.65±1.26)顯著低于A組(9190±988、67.50±4.56)(均P0.01);C組(2932±700、18.41±1.48)顯著低于B組(均P0.01);D組(5046±732、39.07±1.33)顯著高于B組(均P0.01);E組(4018±578、28.14±1.35)顯著高于C組(均P0.01)。(3)AM mTOR mRNA、蛋白及活性(p-mTOR):B組mTOR mRNA、蛋白及活性(2.62±0.46)(1.30±0.52)(1.46±0.43)均顯著高于A組(1.00±0.00)(0.48±0.27)(0.58±0.26)(均P0.01);C組(3.61±0.52)(2.50±0.47)(2.66±0.52)顯著高于B組(均P0.01);D組(1.83±0.43)(0.91±0.31)(0.97±0.31)顯著低于B組(P0.01、P0.05);E組(2.84±0.49)(1.84±0.43)(1.90±0.44)顯著低于C組(均P0.01)。(4)AM Cdc42 mRNA、蛋白及活性:B組mRNA、蛋白及活性(2.56±0.50)(1.61±0.37)(0.46±0.09)顯著高于A組(1.00±0.00)(0.67±0.22)(0.30±0.07)(均P0.01);C組(3.66±0.54)(2.70±0.48)(0.62±0.10)顯著高于B組(均P0.01);D組(1.77±0.44)(1.00±0.30)(0.37±0.08)顯著低于B組(P0.01、P0.05);E組(2.67±0.48)(2.00±0.57)(0.52±0.06)顯著低于C組(均P0.01)。(5)AM細(xì)胞骨架:B組細(xì)胞周圍可見明顯的絲狀偽足和板狀偽足;C組細(xì)胞形狀不規(guī)則,細(xì)胞周圍絲狀偽足伸出雜亂、長短不一,板狀偽足面積增加;D組細(xì)胞周圍可見少量絲狀偽足和板狀偽足;E組細(xì)胞變圓,絲狀偽足較少,排列相對整齊,細(xì)胞與細(xì)胞接觸的部分出現(xiàn)膜皺褶;A組細(xì)胞形狀規(guī)則,未見上述改變。(6)相關(guān)性分析:基礎(chǔ)狀態(tài)、PM2.5干預(yù)、EGCG干預(yù)及PM2.5聯(lián)合EGCG干預(yù)后小鼠AM mTOR、Cdc42的mRNA、蛋白及活性與MFI均呈負(fù)相關(guān)(P0.01、0.05);基礎(chǔ)狀態(tài)、PM2.5干預(yù)、EGCG干預(yù)及PM2.5聯(lián)合EGCG干預(yù)后小鼠AM mTOR的mRNA、蛋白及活性與Cdc42的mRNA、蛋白及活性均呈正相關(guān)(P0.01、0.05)。結(jié)論:1.單純香煙煙霧持續(xù)暴露可成功復(fù)制慢阻肺小鼠模型;2.慢阻肺小鼠AM吞噬功能降低,PM2.5加劇慢阻肺小鼠AM吞噬功能障礙;3.mTOR-Cdc42信號通路在慢阻肺小鼠AM中處于活化狀態(tài),PM2.5促進(jìn)該信號通路活化;4.mTOR-Cdc42信號通路活化致AM細(xì)胞骨架不恰當(dāng)重排與AM吞噬功能低下相關(guān);5.EGCG抑制慢阻肺mTOR-Cdc42信號通路,增強(qiáng)慢阻肺小鼠AM吞噬功能。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563.9
【圖文】：

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 mTOR-Cdc42 信號通路在 PM2.5 加劇慢阻肺小鼠 AM 吞噬功能缺陷中的作用及機(jī)制研究隔 3-4h，連續(xù)熏煙 90d（圖 1）。

2.1.2 肺功能測定參照文獻(xiàn)[96-97]于造模結(jié)束后，行小鼠無創(chuàng)肺功能測定，將小鼠置于無創(chuàng)全體體積描記箱內(nèi)，在清醒、自由活動狀態(tài)下，行無創(chuàng)肺功能測試，選取吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流速（PEF）和呼出 50%潮氣量時的流速（EF50）作為小鼠肺功能的評定指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（圖 2）。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黨苗苗;mTOR-Cdc42信號通路在PM2.5加劇慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能障礙中的作用及機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2016年

本文編號：2733164