發(fā)布時間：2020-06-25 02:13

【摘要】：目的：本研究通過構建攜帶增殖抑制基因(rHSG)的真核表達載體,轉染至慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氣道成纖維細胞,觀察COPD大鼠氣道成纖維細胞增殖、凋亡及轉化生長因子(TGF-β1)、血小板衍生長因子(PDGF)表達水平關系,為干預氣道成纖維細胞增殖引起肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病,打下基因治療基礎,并為尋找到延緩COPD病情進展提供了理論依據(jù)。 方法：采用SD雄性大鼠構建COPD大鼠模型,運用組織塊貼壁法,體外培養(yǎng)COPD大鼠氣道原代成纖維細胞,并用波形蛋白鑒定細胞,取3代細胞進行后續(xù)實驗。通過分子克隆,構建攜帶rHSG基因的真核表達載體,實驗分組為：對照組(COPD模型未轉染組)、空載體pEGFP-nl組、轉染pEGFP-rHSG組,實驗將陽離子脂質體作為轉染介質,把重組質粒轉染到COPD模型大鼠氣道成纖維細胞,分別感染24小時、48小時、3天、5天、7天后,使用MTT方法檢測轉染后成纖維細胞增殖凋亡情況；Western blot檢測轉染后rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白含量；提取總RNA,逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測TGF-β1、PDGF及rHSGmRNA的表達水平。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,應用SPSS18.0軟件,得到實驗數(shù)據(jù)用x±s表示,采用單因素方差分析均數(shù)、標準差,P0.05為有顯著性統(tǒng)計學意義。 結果：COPD大鼠氣道成纖維細胞原代培養(yǎng)成功,經(jīng)過免疫組化,波形蛋白鑒定呈陽性。隨著rHSG基因轉染大鼠氣道成纖維細胞時間延長,rHSG基因轉染組明顯比模型對照組對成纖維細胞的增殖有抑制作用；TGF-β1、PDGF兩個基因的mRNA表達量減少出現(xiàn)在轉染24小時,其mRNA的表達量減少值達到了最大在7天的時侯,在5天-7天時候mRNA表達量也有減少,但是幅度較前減小各轉染組間TGF-β1、PDGFmRNA表達量差別,滿足P0.05。當pEGFP-rHSG轉染到細胞24小時,rHSGmRNA表達量開始增加,增加值達到最大在7天的時侯,而轉染5d-7d時表達仍有繼續(xù)增加,但增加幅度較前面明顯,各轉染組間rHSG mRNA表達差別滿足P0.05。 結論：rHSG基因與TGF-β1、PDGF基因的平衡關系被打破,是COPD氣道重塑中至關因素。rHSG基因轉染組隨著感染時間延長明顯夠抑制COPD氣道成纖維細胞增殖,相反COPD氣道成纖維細胞中TGF-β1與PDGF隨著rHSG基因感染時間延長出現(xiàn)低表達,證實當外源性rHSG基因轉染到COPD大鼠氣道成纖維細胞,能夠調(diào)節(jié)TGF-β1、PDGF基因的過度表達,進而使氣道成纖維細胞的增殖受到抑制。因此高效率的rHSG基因轉染有可能會在一定程度上延緩COPD氣道重塑進展。
【學位授予單位】：貴陽中醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R563.9

【參考文獻】

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本文編號：2728709