【摘要】：目的：本研究通過構(gòu)建攜帶增殖抑制基因(rHSG)的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氣道成纖維細(xì)胞,觀察COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、血小板衍生長因子(PDGF)表達(dá)水平關(guān)系,為干預(yù)氣道成纖維細(xì)胞增殖引起肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病,打下基因治療基礎(chǔ),并為尋找到延緩COPD病情進(jìn)展提供了理論依據(jù)。 方法：采用SD雄性大鼠構(gòu)建COPD大鼠模型,運(yùn)用組織塊貼壁法,體外培養(yǎng)COPD大鼠氣道原代成纖維細(xì)胞,并用波形蛋白鑒定細(xì)胞,取3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過分子克隆,構(gòu)建攜帶rHSG基因的真核表達(dá)載體,實(shí)驗(yàn)分組為：對照組(COPD模型未轉(zhuǎn)染組)、空載體pEGFP-nl組、轉(zhuǎn)染pEGFP-rHSG組,實(shí)驗(yàn)將陽離子脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染介質(zhì),把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COPD模型大鼠氣道成纖維細(xì)胞,分別感染24小時(shí)、48小時(shí)、3天、5天、7天后,使用MTT方法檢測轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞增殖凋亡情況；Western blot檢測轉(zhuǎn)染后rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白含量；提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TGF-β1、PDGF及rHSGmRNA的表達(dá)水平。對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,應(yīng)用SPSS18.0軟件,得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示,采用單因素方差分析均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差,P0.05為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功,經(jīng)過免疫組化,波形蛋白鑒定呈陽性。隨著rHSG基因轉(zhuǎn)染大鼠氣道成纖維細(xì)胞時(shí)間延長,rHSG基因轉(zhuǎn)染組明顯比模型對照組對成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用；TGF-β1、PDGF兩個(gè)基因的mRNA表達(dá)量減少出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24小時(shí),其mRNA的表達(dá)量減少值達(dá)到了最大在7天的時(shí)侯,在5天-7天時(shí)候mRNA表達(dá)量也有減少,但是幅度較前減小各轉(zhuǎn)染組間TGF-β1、PDGFmRNA表達(dá)量差別,滿足P0.05。當(dāng)pEGFP-rHSG轉(zhuǎn)染到細(xì)胞24小時(shí),rHSGmRNA表達(dá)量開始增加,增加值達(dá)到最大在7天的時(shí)侯,而轉(zhuǎn)染5d-7d時(shí)表達(dá)仍有繼續(xù)增加,但增加幅度較前面明顯,各轉(zhuǎn)染組間rHSG mRNA表達(dá)差別滿足P0.05。 結(jié)論：rHSG基因與TGF-β1、PDGF基因的平衡關(guān)系被打破,是COPD氣道重塑中至關(guān)因素。rHSG基因轉(zhuǎn)染組隨著感染時(shí)間延長明顯夠抑制COPD氣道成纖維細(xì)胞增殖,相反COPD氣道成纖維細(xì)胞中TGF-β1與PDGF隨著rHSG基因感染時(shí)間延長出現(xiàn)低表達(dá),證實(shí)當(dāng)外源性rHSG基因轉(zhuǎn)染到COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞,能夠調(diào)節(jié)TGF-β1、PDGF基因的過度表達(dá),進(jìn)而使氣道成纖維細(xì)胞的增殖受到抑制。因此高效率的rHSG基因轉(zhuǎn)染有可能會(huì)在一定程度上延緩COPD氣道重塑進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：貴陽中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R563.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2728709