【摘要】：目的以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為對(duì)象研究胰島素作用下肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)表達(dá)的變化及其可能機(jī)制,并觀察胰島素作用下對(duì)A549細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的凋亡的影響。進(jìn)一步通過脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型研究胰島素作用下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清炎癥介質(zhì)的變化、對(duì)肺干濕重比的影響,及對(duì)肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道表達(dá)的調(diào)控及機(jī)制,了解胰島素對(duì)炎癥、肺水腫清除等方面的影響。 方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn):以A549細(xì)胞為對(duì)象,用含30U/L的胰島素培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min和60 min,分別用蛋白免疫印跡法(Western blotting)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定ENaC-α及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK-1)的蛋白及mRNA表達(dá),并使用白屈菜紅堿阻斷蛋白激酶C(PKC)抑制SGK-1后再次測定ENaC-α蛋白表達(dá)。用原位末端缺刻標(biāo)記法(TUNEL)測定經(jīng)胰島素處理后的A549細(xì)胞在缺氧條件下誘導(dǎo)凋亡,比較兩組凋亡率變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):72只成年健康SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組24只,經(jīng)腹腔注射麻醉(戊巴比妥鈉50mg/kg)(1)胰島素治療組(T組,24只):大鼠麻醉后,經(jīng)頸靜脈插管按5mg/kg劑量注射LPS,兩小時(shí)后微量泵泵入含0.5U/ml胰島素的生理鹽水溶液1ml/h,術(shù)中監(jiān)測血糖,調(diào)節(jié)泵速使血糖在2.8-3.2mmol/l之間;(2)LPS模型組(L組,24只):大鼠麻醉后,經(jīng)頸靜脈插管按5mg/kg劑量注射LPS,兩小時(shí)后微量泵泵入生理鹽水1ml/h;(3)對(duì)照組(C組,24只):試驗(yàn)中單純給予生理鹽水,首次劑量1ml/kg,兩小時(shí)后微量泵持續(xù)泵入生理鹽水1ml/h。以首次注射后兩小時(shí)為0點(diǎn),分別于0,30分鐘,1小時(shí),2小時(shí)抽取靜脈血后處死,取肺標(biāo)本。采集血清,測TNF-α、IL-1β水平。取右肺稱濕質(zhì)量后,置70℃恒溫烤箱中,烘烤72 h至其質(zhì)量不再變化后測定肺臟干質(zhì)量,計(jì)算肺濕/干重比右肺組織用于測量肺干濕重比,一部分左肺組織福爾馬林固定,HE染色光鏡下觀察炎癥反應(yīng)情況及上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,按病理變化評(píng)分,比較炎癥及損傷程度。其余肺組織勻漿,用western-blot法檢測肺組織中SGK-1表達(dá)的變化。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法測定ENaC及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK-1)的mRNA,了解其轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)果用胰島素培養(yǎng)30 min即明顯上調(diào)ENaC-α和SGK-1的蛋白和mRNA表達(dá)表達(dá),并隨處理時(shí)間延長表達(dá)量明顯增加(P0.05)。胰島素還可以抑制缺氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(10.3%比21.6%,P0.05)。若以未添加胰島素培養(yǎng)A549細(xì)胞蛋白表達(dá)量為100%,胰島素作用30 min時(shí)ENaC-α、SGK-1蛋白表達(dá)量為124%、135%,60 min時(shí)ENaC-α、SGK-1蛋白表達(dá)量為186%、176%。胰島素治療后1小時(shí)組織病理學(xué)(4.30±1.6,5.10±1.9 P0.05)、炎癥指標(biāo)(IL-1β26.27±6.67,31.5±7.78 P 0.05 ; TNF-α243.1±54.65 , 291.71±63.56 P 0.05 ; IL-8 ,451.53±41.19,538.29±45.14 P0.05;PCT 570.96±46.88, 525.91±32.17 P0.05)、肺濕/干重比(5.33±1.57,6.32±1.35 P0.05),有明顯好轉(zhuǎn),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肺損傷模型建立后,ENaC和SGK-1與對(duì)照組比較,表達(dá)明顯下降,兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),經(jīng)胰島素治療后SGK-1的蛋白表達(dá)增高,SGK-1與ENaC轉(zhuǎn)錄水平增高,與模型組比較兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中胰島素可以通過PKC、SGK-1途徑上調(diào)ENaC表達(dá),并抑制缺氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中加用胰島素治療可以抑制ALI/ARDS的炎癥反應(yīng)并通過上皮鈉離子通道表達(dá)的增加,提高肺水腫清除能力,減輕肺水腫。 因此我們認(rèn)為胰島素在ALI/ARDS病程中具有一定的保護(hù)和治療作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉紅菊;陶曉南;辛建寶;熊先智;尚丹;;中藥熱毒寧對(duì)急性肺損傷兔肺內(nèi)致炎因子的影響[J];中國新藥與臨床雜志;2007年06期

2 王導(dǎo)新;張玲;王智彪;陳文直;杜永洪;;壓縮肺排肺泡液術(shù)與控制性肺膨張術(shù)對(duì)中、重度ARDS模型beagle犬的實(shí)驗(yàn)研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年06期

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本文編號(hào)：2720734