【摘要】： 第一部分哮喘小鼠模型的制備 目的制備哮喘小鼠模型。 方法將3周齡雄性SPF級Balb／c小鼠16只，隨機分成哮喘組和對照組，每組8只。哮喘組于第0、7、14天每只腹腔內(nèi)注射抗原混懸液0.1ml(含雞卵清蛋白10mg和氫氧化鋁干粉10mg溶于生理鹽水中)致敏；第15天開始霧化吸入1％OVA激發(fā)哮喘，每周2至3次，每次30min，連續(xù)6周。對照組以等量生理鹽水進行致敏和激發(fā)，每周2至3次，每次30min，連續(xù)6周。兩組小鼠均于末次霧化吸入后24小時頸椎脫臼處死，無菌取氣管作細胞培養(yǎng)實驗，取左肺中葉作肺組織HE染色。 結(jié)果 1．哮喘組小鼠在霧化致喘后出現(xiàn)較明顯的頭、面部搔癢，進而呼吸加深、加快、點頭樣喘息明顯、安靜少動、弓背、前肢縮抬，掌面出現(xiàn)明顯皮疹。對照組小鼠無喘息等表現(xiàn)。 2．肺組織切片HE染色可見正常組小鼠氣道上皮完整，無炎細胞浸潤及平滑肌層增厚等改變；哮喘組小鼠有氣道上皮細胞破壞，支氣管周圍有大量嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤及平滑肌細胞層增厚等改變結(jié)果。 結(jié)論本實驗成功制備了小鼠哮喘模型，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分原代培養(yǎng)小鼠氣道平滑肌細胞 目的建立原代培養(yǎng)小鼠的氣道平滑肌細胞的可行方法，為相關(guān)疾病的研究提供實驗材料。 方法選取正常組和哮喘組同周齡的Balb／c小鼠，運用組織貼塊法培養(yǎng)小鼠的氣道平滑肌細胞，并綜合了自然純化、機械刮除法、時差貼壁法等多種方法純化氣道平滑肌細胞。 結(jié)果接種的組織塊活力良好，第三代氣道平滑肌細胞純度可以達到95％以上。運用間接免疫熒光法對平滑肌細胞α-肌動蛋白(α-actin)進行免疫細胞化學(xué)染色，90％以上細胞染色結(jié)果為陽性，凍存后復(fù)蘇細胞活力良好。 結(jié)論對于取材較少、操作相對困難的小鼠氣道平滑肌細胞，以組織貼塊法原代培養(yǎng)較為可靠，方法簡便，獲得ASMC純度較高，為進行相關(guān)細胞生物學(xué)研究提供了材料。 第三部分哮喘小鼠氣道平滑肌細胞增殖及cyclin D1表達的差異 目的研究哮喘小鼠氣道重建模型中氣道平滑肌細胞(ASMC)的細胞增殖、細胞周期及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達的變化，探討cyclin D1對支氣管哮喘氣道重建中平滑肌細胞增殖過程及細胞周期的影響，進而為哮喘的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。 方法以原代培養(yǎng)的正常小鼠ASMC為對照組研究哮喘組ASMC，用四唑鹽比色試驗(MTT)檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)(FCM)測定細胞周期，免疫細胞化學(xué)證實cyclinD1在ASMC中的表達，F(xiàn)CM檢測cyclinD1表達量。 結(jié)果 1．MTT法分析哮喘小鼠ASMC的增殖差異：哮喘組小鼠的ASMC與正常組小鼠同代ASMC比較，前者細胞增殖顯著增快，MTT法測得各時間點的哮喘組細胞的平均A值均高于正常組細胞，差異有顯著性(P＜0.05)。 2．FCM分析哮喘小鼠ASMC周期變化：哮喘組細胞周期與正常組有顯著差別，哮喘組增殖期(S期)百分比較正常組明顯增高。 3．免疫熒光細胞化學(xué)觀察Cyclin D1在ASMC表達情況：用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，正常、哮喘兩組ASMC均有Cyclin D1的表達，主要分布于胞質(zhì)內(nèi)。 4．FCM分析Cyclin D1在哮喘小鼠ASMC中的差異表達。3次分析取材于ASMC生長周期中的不同時間點，各次的2組間比較結(jié)果的趨勢一致：哮喘組細胞表達的Cyclin D1顯著高于A組的表達，差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論在哮喘氣道重建過程中ASMC經(jīng)歷了一定程度的過增殖過程，cyclin D1的表達增加參與了細胞增殖。氣道重建環(huán)境可刺激氣道平滑肌細胞增殖能力。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R562.25
【圖文】：

炎細胞浸潤及平滑j]L層增厚等改變;哮喘組刁、鼠氣道上皮細胞水腫、破壞，肺泡隔增厚，支氣管及血管周圍有大量嗜酸性粒細胞等炎性細胞浸潤及平滑肌細胞層增厚等改變。(圖1)

圖2.ASMC原代培養(yǎng)后的相差顯微鏡觀察(/10的左圖為3天，右圖為7天。F192.Phase一eontrastmieroseoPyofsmoothmuseleeelluPon3and7dayseultUre圖3培養(yǎng)第4代的ASMC193ThefourthPassageeulturedmouseASMCs(X100)

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 卓致遠;哮喘小鼠氣道平滑肌原代細胞增殖周期及細胞周期蛋白D1表達的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號：2719810