【摘要】： 第一部分高氧暴露所致線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷關(guān)系的研究 實(shí)驗(yàn)一高氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ、Ⅴ表達(dá)的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ(cytochrome b，Cytb)、Ⅴ(Adenosine Triphosphate Synthase6，8，ATPase6，8)動態(tài)表達(dá)的影響。探討高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關(guān)系。 【方法】參照本研究室前期研究建立的早產(chǎn)鼠高氧肺損傷模型。早產(chǎn)新生SD大鼠生后1d隨機(jī)分為空氣組、高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓氧艙中，氧濃度為85％；空氣組置于同一室常壓空氣中。兩組分別于高氧或空氣暴露后1、4、7、10和14d提取肺組織總RNA和蛋白，采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)測定Cytb、ATPase6，8 mRNA水平的動態(tài)表達(dá)；同時應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測肺組織切片中Cytb蛋白分布和表達(dá)；應(yīng)用Western blot檢測肺組織Cytb蛋白水平的動態(tài)表達(dá)。 【結(jié)果】(1)與空氣組相比，高氧暴露1、4d Cytb mRNA含量及其表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；7d后Cytb呈下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。隨日齡變化高氧暴露后，肺組織Cytb免疫組織化學(xué)結(jié)果與Cytb mRNA表達(dá)相似。 (2) Western blot結(jié)果顯示，與空氣組相比，高氧暴露1、4d肺組織Cytb蛋白表達(dá)增強(qiáng)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；7d后Cytb呈逐漸下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱，但7、10d兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14d極顯著減弱。 (3)與空氣組相比，高氧暴露1d時ATPase6 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，4d雖仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，7、10d時減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，14d又出現(xiàn)極顯著增強(qiáng)(P＜0.05)； 與空氣組相比，高氧暴露1、4d時ATPase8 mRNA表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，7d后開始出現(xiàn)增強(qiáng)，7、14d時顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，10d時雖仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 【結(jié)論】高氧暴露誘導(dǎo)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ、Ⅴ表達(dá)水平的改變，可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應(yīng)激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。 實(shí)驗(yàn)二高氧暴露對人肺腺癌A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ表達(dá)的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的肺腺癌A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ(NADH dehydrogenase subunit 1，ND1)、Ⅳ(cytochromeoxidaseⅠ，COXⅠ)動態(tài)表達(dá)的影響。探討高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關(guān)系。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機(jī)分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h提取A549細(xì)胞總RNA，采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定ND1、COXⅠmRNA的表達(dá)。 【結(jié)果】(1)與同時間點(diǎn)空氣組相比，高氧暴露12h A549細(xì)胞ND1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高氧組24h ND1 mRNA的表達(dá)顯著減弱(P＜0.05)；高氧組48h ND1 mRNA的表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)與同時間點(diǎn)空氣組相比，高氧暴露12h A549細(xì)胞COXⅠmRNA的表達(dá)增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高氧暴露24、48h COXⅠmRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，高氧暴露24h以后COXⅠmRNA的表達(dá)雖比空氣組增強(qiáng)，但呈下降趨勢。 【結(jié)論】高氧暴露誘導(dǎo)A549細(xì)胞線粒體呼吸鏈ND1、COXⅠ表達(dá)水平的改變，提示高氧暴露所致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。 第二部分高氧暴露對人肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2，Trx-2)及細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cytc)表達(dá)的影響，探討Trx-2和Cytc的表達(dá)變化在高氧肺損傷發(fā)生發(fā)展中所起的作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體的保護(hù)作用。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機(jī)分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h提取A549細(xì)胞總RNA和蛋白，采取半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定Trx-2、Cytc mRNA的表達(dá)；采用Westernblot檢測A549細(xì)胞Trx-2蛋白的表達(dá)變化。 【結(jié)果】(1)與空氣組相比，高氧暴露12 h A549細(xì)胞Trx-2 mRNA表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。24 h Trx-2 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；48 h后Trx-2呈下降趨勢，其表達(dá)較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)與空氣組相比，高氧暴露12h Cytc mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，24h Cytc mRNA的表達(dá)減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，48h顯著減弱(P＜0.05)。 (3)與空氣組相比，高氧暴露12h Trx-2蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，24h Trx-2蛋白的表達(dá)仍增強(qiáng)，但兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，隨后逐漸減弱，至48h顯著減弱(P＜0.05)。 【結(jié)論】高濃度氧暴露誘導(dǎo)A549細(xì)胞中Trx-2和Cytc異常表達(dá)，提示Cytc在高氧肺損傷細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護(hù)作用。 第三部分小分子干擾RNA抑制高氧暴露下A549細(xì)胞中Trx-2表達(dá)及其與肺細(xì)胞代謝和凋亡的關(guān)系 【目的】研究小分子干擾RNA(small interference RNA，SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549細(xì)胞中硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2，Trx-2)表達(dá)及其與肺細(xì)胞代謝和凋亡的關(guān)系，探討高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制和防治措施。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，將體外化學(xué)合成Trx-2序列特異性的SiRNA通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。隨機(jī)分為Ⅰ空氣組，Ⅱ高氧組，Ⅲ小分子干擾RNA空氣組，Ⅳ小分子干擾RNA高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度為95％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。四組分別于高氧或空氣暴露12、24、48h提取A549細(xì)胞總RNA和蛋白。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6，8(ATPase6，8)及細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cytc)mRNA的表達(dá)，采用Westernblot方法檢測Trx-2蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測高氧暴露和沉默Trx-2基因?qū)549細(xì)胞凋亡的影響。 【結(jié)果】(1)序列特異性SiRNA可顯著抑制Trx-2表達(dá)，Western blot檢測顯示Trx-2蛋白表達(dá)明顯下降，SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3三組中Trx-2蛋白表達(dá)均受到抑制，SiRNA-1組抑制效率最高(79.51％)。 (2)與空氣組相比，高氧組24h Trx-2和Cytc mRNA的表達(dá)顯著增高，但在48h Cytc mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h Trx-2mRNA的表達(dá)顯著減弱但在12、24h Cytc mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組48h Trx-2mRNA的表達(dá)顯著減弱，而24h Cytc mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。 (3)與空氣組相比，高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，但在24、48h ATPase8 mRNA的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h ATPase6，8 mRNA的表達(dá)顯著減弱(P＜0.05)。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達(dá)顯著減弱，而12、48h ATPase8 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。 (4)與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組24h A549細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯增高(P＜0.05)，分別為(31.78±4.52)％VS(13.57±0.69)％；小分子干擾RNA高氧組24、48h A549細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯高于小分子干擾RNA空氣組(P＜0.05)，分別為(31.78±4.52)％MS(15.47±0.57)％，(38.51±4.08)％VS(25.84±1.01)％。 【結(jié)論】高氧暴露和沉默Trx-2基因?qū)е翧549細(xì)胞ATPase6，8表達(dá)異常和Cytc表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡百分率顯著增高，提示能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡參與高氧肺損傷發(fā)病過程，Trx-2對高氧肺損傷線粒體起重要的保護(hù)作用，保護(hù)線粒體DNA(mtDNA)可能是Trx系統(tǒng)抗高氧肺損傷的重要機(jī)制。 小結(jié) 1本研究成功建立早產(chǎn)鼠高氧肺損傷動物模型和高氧暴露A549細(xì)胞損傷模型，為從線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能改變的角度探討高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 2高氧暴露誘導(dǎo)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表達(dá)水平的改變，可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應(yīng)激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷發(fā)病過程中起重要作用。 3高濃度氧暴露誘導(dǎo)A549細(xì)胞中Trx-2和Cytc異常表達(dá)，提示Cytc在高氧肺損傷細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護(hù)作用。 4高氧暴露和沉默Trx-2基因?qū)е翧549細(xì)胞ATPase6，8表達(dá)異常和Cytc表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡百分率顯著增高，提示能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡參與高氧腫損傷發(fā)病過程，Trx-2對高氧肺損傷線粒體起重要的保護(hù)作用，保護(hù)線粒體DNA可能是硫氧還蛋白系統(tǒng)抗高氧肺損傷的重要機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R563
【圖文】：

但7、IOd兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，(P<0.05)。見表5，圖14。圖:圖1一10示:兩組肺組織各時間點(diǎn)Cytb免化染色(sP法)結(jié)圖l空氣組ld(sPxZOO)圖2高氧組ld(spxZOO)

但7、IOd兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，(P<0.05)。見表5，圖14。圖:圖1一10示:兩組肺組織各時間點(diǎn)Cytb免化染色(sP法)結(jié)圖l空氣組ld(sPxZOO)圖2高氧組ld(spxZOO)

【參考文獻(xiàn)】

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1 陸松敏,李偉文,王正國;缺血缺氧與線粒體DNA損傷[J];創(chuàng)傷外科雜志;2001年04期

2 周林,萬大方,張國元,李宏年,張萍萍,趙新泰,顧健人,LiewCC;高血壓患者及大鼠線粒體ATPase 6基因的克隆、表達(dá)與突變研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1999年10期

3 張嵐,蔡美琴;線粒體氧化損傷與衰老[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);2005年04期

4 王友臣,阮士榮;線粒體損傷與氧自由基的關(guān)系[J];華北國防醫(yī)藥;2003年04期

5 容志惠;李文斌;張謙慎;常立文;;慢性肺部疾病患兒肺灌洗液中生物標(biāo)記物的研究[J];臨床兒科雜志;2007年03期

6 王利玲,常立文,李文斌,劉漢楚,容志惠,張謙慎,陳紅兵,祝華平;高氧對早產(chǎn)大鼠角化細(xì)胞生長因子mRNA及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響[J];小兒急救醫(yī)學(xué);2005年01期

7 樊廷俊,夏蘭,韓貽仁;線粒體與細(xì)胞凋亡[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;2001年01期

8 江海洪,謝燕,劉澤軍;線粒體呼吸鏈功能調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2001年04期

9 Giovanni E．Mann;J(o|¨)rg Niehueser-Saran;Alan Watson;Tetsuro Ishii;Patricia de Winter;Richard C．M．Siow;;內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激時Nrf2／ARE信號通路對抗氧化基因表達(dá)的調(diào)控:與動脈粥樣硬化和先兆子癇的關(guān)系[J];生理學(xué)報;2007年02期

10 付雪梅,李煒如,姚裕家,翟朝陽,向龍,石晶,楊惠明,唐軍;缺氧缺血性腦損傷新生豬海馬皮層細(xì)胞色素C氧化酶活性變化[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2004年02期

本文編號：2718323