【摘要】： 第一部分高氧暴露所致線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷關系的研究 實驗一高氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ、Ⅴ表達的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對早產(chǎn)新生大鼠肺組織線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ(cytochrome b，Cytb)、Ⅴ(Adenosine Triphosphate Synthase6，8，ATPase6，8)動態(tài)表達的影響。探討高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關系。 【方法】參照本研究室前期研究建立的早產(chǎn)鼠高氧肺損傷模型。早產(chǎn)新生SD大鼠生后1d隨機分為空氣組、高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓氧艙中，氧濃度為85％；空氣組置于同一室常壓空氣中。兩組分別于高氧或空氣暴露后1、4、7、10和14d提取肺組織總RNA和蛋白，采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)測定Cytb、ATPase6，8 mRNA水平的動態(tài)表達；同時應用免疫組織化學方法(SP法)檢測肺組織切片中Cytb蛋白分布和表達；應用Western blot檢測肺組織Cytb蛋白水平的動態(tài)表達。 【結果】(1)與空氣組相比，高氧暴露1、4d Cytb mRNA含量及其表達顯著增強(P＜0.05)；7d后Cytb呈下降趨勢，其表達較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。隨日齡變化高氧暴露后，肺組織Cytb免疫組織化學結果與Cytb mRNA表達相似。 (2) Western blot結果顯示，與空氣組相比，高氧暴露1、4d肺組織Cytb蛋白表達增強但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；7d后Cytb呈逐漸下降趨勢，其表達較空氣組減弱，但7、10d兩者相比差異無統(tǒng)計學意義，14d極顯著減弱。 (3)與空氣組相比，高氧暴露1d時ATPase6 mRNA表達顯著增強(P＜0.05)，4d雖仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，7、10d時減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，14d又出現(xiàn)極顯著增強(P＜0.05)； 與空氣組相比，高氧暴露1、4d時ATPase8 mRNA表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，7d后開始出現(xiàn)增強，7、14d時顯著增強(P＜0.05)，10d時雖仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 【結論】高氧暴露誘導線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ、Ⅴ表達水平的改變，可能導致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。 實驗二高氧暴露對人肺腺癌A549細胞線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅳ表達的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的肺腺癌A549細胞線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ(NADH dehydrogenase subunit 1，ND1)、Ⅳ(cytochromeoxidaseⅠ，COXⅠ)動態(tài)表達的影響。探討高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙與高氧肺損傷的關系。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h提取A549細胞總RNA，采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定ND1、COXⅠmRNA的表達。 【結果】(1)與同時間點空氣組相比，高氧暴露12h A549細胞ND1 mRNA的表達增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；高氧組24h ND1 mRNA的表達顯著減弱(P＜0.05)；高氧組48h ND1 mRNA的表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (2)與同時間點空氣組相比，高氧暴露12h A549細胞COXⅠmRNA的表達增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；高氧暴露24、48h COXⅠmRNA的表達顯著增強(P＜0.05)，高氧暴露24h以后COXⅠmRNA的表達雖比空氣組增強，但呈下降趨勢。 【結論】高氧暴露誘導A549細胞線粒體呼吸鏈ND1、COXⅠ表達水平的改變，提示高氧暴露所致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷的發(fā)病過程中起重要作用。 第二部分高氧暴露對人肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2及細胞色素C表達的影響 【目的】研究高濃度氧暴露對人肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2，Trx-2)及細胞色素C(cytochrome c，Cytc)表達的影響，探討Trx-2和Cytc的表達變化在高氧肺損傷發(fā)生發(fā)展中所起的作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體的保護作用。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，隨機分為高氧組和空氣組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度＞90％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。兩組分別于高氧或空氣暴露12、24、48 h提取A549細胞總RNA和蛋白，采取半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定Trx-2、Cytc mRNA的表達；采用Westernblot檢測A549細胞Trx-2蛋白的表達變化。 【結果】(1)與空氣組相比，高氧暴露12 h A549細胞Trx-2 mRNA表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。24 h Trx-2 mRNA表達顯著增強(P＜0.05)；48 h后Trx-2呈下降趨勢，其表達較空氣組減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (2)與空氣組相比，高氧暴露12h Cytc mRNA的表達顯著增強(P＜0.05)，24h Cytc mRNA的表達減弱，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，48h顯著減弱(P＜0.05)。 (3)與空氣組相比，高氧暴露12h Trx-2蛋白的表達顯著增強(P＜0.05)，24h Trx-2蛋白的表達仍增強，但兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，隨后逐漸減弱，至48h顯著減弱(P＜0.05)。 【結論】高濃度氧暴露誘導A549細胞中Trx-2和Cytc異常表達，提示Cytc在高氧肺損傷細胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護作用。 第三部分小分子干擾RNA抑制高氧暴露下A549細胞中Trx-2表達及其與肺細胞代謝和凋亡的關系 【目的】研究小分子干擾RNA(small interference RNA，SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549細胞中硫氧還蛋白-2(thioredoxin-2，Trx-2)表達及其與肺細胞代謝和凋亡的關系，探討高氧肺損傷的發(fā)病機制和防治措施。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細胞系，待其在37℃5％CO_2培養(yǎng)箱中生長至接近亞匯合狀態(tài)時，將體外化學合成Trx-2序列特異性的SiRNA通過Lipofectamine 2000轉染A549細胞。隨機分為Ⅰ空氣組，Ⅱ高氧組，Ⅲ小分子干擾RNA空氣組，Ⅳ小分子干擾RNA高氧組。高氧組持續(xù)暴露于常壓高濃度氧中，氧濃度為95％，CO_2濃度為5％；空氣組仍置于含5％CO_2培養(yǎng)箱中。四組分別于高氧或空氣暴露12、24、48h提取A549細胞總RNA和蛋白。采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6，8(ATPase6，8)及細胞色素C(cytochrome c，Cytc)mRNA的表達，采用Westernblot方法檢測Trx-2蛋白的表達，流式細胞術檢測高氧暴露和沉默Trx-2基因對A549細胞凋亡的影響。 【結果】(1)序列特異性SiRNA可顯著抑制Trx-2表達，Western blot檢測顯示Trx-2蛋白表達明顯下降，SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3三組中Trx-2蛋白表達均受到抑制，SiRNA-1組抑制效率最高(79.51％)。 (2)與空氣組相比，高氧組24h Trx-2和Cytc mRNA的表達顯著增高，但在48h Cytc mRNA的表達顯著降低(P＜0.05)。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h Trx-2mRNA的表達顯著減弱但在12、24h Cytc mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組48h Trx-2mRNA的表達顯著減弱，而24h Cytc mRNA表達顯著升高(P＜0.05)。 (3)與空氣組相比，高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達顯著增高(P＜0.05)，但在24、48h ATPase8 mRNA的表達顯著增高(P＜0.05)。與小分子干擾RNA空氣組相比，小分子干擾RNA高氧組24、48h ATPase6，8 mRNA的表達顯著減弱(P＜0.05)。與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組12、48h ATPase6 mRNA的表達顯著減弱，而12、48h ATPase8 mRNA表達顯著升高(P＜0.05)。 (4)與高氧組相比，小分子干擾RNA高氧組24h A549細胞凋亡百分數(shù)明顯增高(P＜0.05)，分別為(31.78±4.52)％VS(13.57±0.69)％；小分子干擾RNA高氧組24、48h A549細胞凋亡百分數(shù)明顯高于小分子干擾RNA空氣組(P＜0.05)，分別為(31.78±4.52)％MS(15.47±0.57)％，(38.51±4.08)％VS(25.84±1.01)％。 【結論】高氧暴露和沉默Trx-2基因導致A549細胞ATPase6，8表達異常和Cytc表達升高，細胞凋亡百分率顯著增高，提示能量代謝障礙和細胞凋亡參與高氧肺損傷發(fā)病過程，Trx-2對高氧肺損傷線粒體起重要的保護作用，保護線粒體DNA(mtDNA)可能是Trx系統(tǒng)抗高氧肺損傷的重要機制。 小結 1本研究成功建立早產(chǎn)鼠高氧肺損傷動物模型和高氧暴露A549細胞損傷模型，為從線粒體呼吸鏈酶復合體結構和功能改變的角度探討高氧肺損傷的發(fā)病機制奠定基礎。 2高氧暴露誘導線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表達水平的改變，可能導致線粒體呼吸鏈氧化磷酸化解偶聯(lián)、“電子漏”產(chǎn)生ROS引起氧化應激和能量代謝障礙，這些變化共同參與高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程，因此，高濃度氧暴露所導致的線粒體呼吸鏈功能障礙可能在高氧肺損傷發(fā)病過程中起重要作用。 3高濃度氧暴露誘導A549細胞中Trx-2和Cytc異常表達，提示Cytc在高氧肺損傷細胞凋亡發(fā)生過程中可能起重要作用，Trx-2對高氧肺損傷線粒體可能起重要的保護作用。 4高氧暴露和沉默Trx-2基因導致A549細胞ATPase6，8表達異常和Cytc表達升高，細胞凋亡百分率顯著增高，提示能量代謝障礙和細胞凋亡參與高氧腫損傷發(fā)病過程，Trx-2對高氧肺損傷線粒體起重要的保護作用，保護線粒體DNA可能是硫氧還蛋白系統(tǒng)抗高氧肺損傷的重要機制。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R563
【圖文】：

但7、IOd兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，(P<0.05)。見表5，圖14。圖:圖1一10示:兩組肺組織各時間點Cytb免化染色(sP法)結圖l空氣組ld(sPxZOO)圖2高氧組ld(spxZOO)

但7、IOd兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，(P<0.05)。見表5，圖14。圖:圖1一10示:兩組肺組織各時間點Cytb免化染色(sP法)結圖l空氣組ld(sPxZOO)圖2高氧組ld(spxZOO)

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陸松敏,李偉文,王正國;缺血缺氧與線粒體DNA損傷[J];創(chuàng)傷外科雜志;2001年04期

2 周林,萬大方,張國元,李宏年,張萍萍,趙新泰,顧健人,LiewCC;高血壓患者及大鼠線粒體ATPase 6基因的克隆、表達與突變研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;1999年10期

3 張嵐,蔡美琴;線粒體氧化損傷與衰老[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);2005年04期

4 王友臣,阮士榮;線粒體損傷與氧自由基的關系[J];華北國防醫(yī)藥;2003年04期

5 容志惠;李文斌;張謙慎;常立文;;慢性肺部疾病患兒肺灌洗液中生物標記物的研究[J];臨床兒科雜志;2007年03期

6 王利玲,常立文,李文斌,劉漢楚,容志惠,張謙慎,陳紅兵,祝華平;高氧對早產(chǎn)大鼠角化細胞生長因子mRNA及增殖細胞核抗原表達的影響[J];小兒急救醫(yī)學;2005年01期

7 樊廷俊,夏蘭,韓貽仁;線粒體與細胞凋亡[J];生物化學與生物物理學報;2001年01期

8 江海洪,謝燕,劉澤軍;線粒體呼吸鏈功能調控機制的研究進展[J];生理科學進展;2001年04期

9 Giovanni E．Mann;J(o|¨)rg Niehueser-Saran;Alan Watson;Tetsuro Ishii;Patricia de Winter;Richard C．M．Siow;;內皮細胞和平滑肌細胞氧化應激時Nrf2／ARE信號通路對抗氧化基因表達的調控:與動脈粥樣硬化和先兆子癇的關系[J];生理學報;2007年02期

10 付雪梅,李煒如,姚裕家,翟朝陽,向龍,石晶,楊惠明,唐軍;缺氧缺血性腦損傷新生豬海馬皮層細胞色素C氧化酶活性變化[J];實用兒科臨床雜志;2004年02期

本文編號：2718323