【摘要】：間質(zhì)性疾病是以肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)與膠原進(jìn)行性積聚為病理特征,最終取代正常肺組織結(jié)構(gòu)而嚴(yán)重影響肺功能、臨床預(yù)后較差的一類(lèi)疾病,以特發(fā)性肺纖維化較為常見(jiàn)。但其發(fā)病機(jī)制仍不明,臨床治療缺乏有效方法。近年,我們采用白三烯抑制劑(leukotriene inhibitor, LTI)進(jìn)行防治肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究,已明確LTI可延緩或抑制肺纖維化,但其機(jī)制尚不清楚,限制了LTI在臨床的應(yīng)用發(fā)展。本研究在我們過(guò)去的研究結(jié)果基礎(chǔ)上,采用經(jīng)典的氣管內(nèi)滴注博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的方法復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型,以LTI齊留通進(jìn)行干預(yù),探討LTI拮抗博萊霉素所致大鼠肺纖維化形成的可能機(jī)制,為其進(jìn)一步在臨床的應(yīng)用提供機(jī)制方面研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章白三烯抑制劑對(duì)肺纖維化的拮抗效應(yīng) 目的采用氣管內(nèi)滴注博萊霉素的方法制備大鼠肺纖維化模型、給予LTI齊留通對(duì)大鼠肺纖維化的形成進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步觀察大鼠動(dòng)物模型肺纖維化形成過(guò)程中肺泡炎及肺纖維化的程度變化和LTI的干預(yù)效應(yīng)。 方法72只SD雄性大鼠隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組(C組)、博萊霉素模型組(B組)和LTI處理組(T組),每組動(dòng)物24只。B組和T組大鼠均采用氣管內(nèi)滴注BLMA5 (5mg/kg)復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型,T組動(dòng)物于造模當(dāng)天始從胃管內(nèi)灌入齊留通溶液(100mg/kg/d), B組動(dòng)物以生理鹽水0.5ml/100g/d灌胃作為T(mén)組動(dòng)物的干預(yù)對(duì)照；C組動(dòng)物的處置與B組和T組動(dòng)物的模型復(fù)制過(guò)程相同,但以等量生理鹽水代替博萊霉素于氣管內(nèi)注入,且以等量生理鹽水代替齊留通溶液灌胃。各組動(dòng)物均在制模開(kāi)始后第7d、14d、28d分別隨機(jī)處死8只動(dòng)物,取左肺下葉組織制作臘塊行病理切片HE染色和Masson染色,顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化程度,堿水解法檢測(cè)肺組織羥脯氨酸濃度,免疫組化技術(shù)檢測(cè)大鼠肺組織α-SMA水平。 結(jié)果(1)肺系數(shù)：B組在氣管內(nèi)滴注博萊霉素后肺系數(shù)各觀察時(shí)間點(diǎn)均明顯高于C組(p0.01),T組動(dòng)物在LTI干預(yù)后在各觀察時(shí)間點(diǎn)均較B組下降(p0.05)。(2)肺組織肺泡炎程度(HE染色)評(píng)分：C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均低；B組較C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均增高(第7天和第14天均p0.01,第28天p0.05)；T組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均較B組為低(p0.05),但較C組仍高(p0.05)。(3)肺組織肺纖維化程度(Masson染色)評(píng)分：C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均低；B組與C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均有增高(第7天p0.05,第14天和第28天均p0.01)；T組在第14天和第28天的評(píng)分均較B組為低(p0.05和p0.01),但在各觀察時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分仍高于C組(p0.05)。(4)肺組織羥脯氨酸(Hyp)含量：制模后第7天,三組動(dòng)物的含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(p0.05)；第14天和第28天B組均較C組增高(p0.01)；第14天T組較B組減低(p0.05),第28天T組較B組減低更明顯(p0.025)。(5)肺組織α-SMA蛋白的表達(dá)：B組和T組與C組相比,第7天表達(dá)水平無(wú)明顯差異；第14天和第28天B組較C組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01)；T組在第14天和第28天均較B組減弱(分別p0.05和0.01),但表達(dá)仍較C組為強(qiáng)(P0.01) 結(jié)論1.BLM氣管內(nèi)滴注可成功復(fù)制大鼠肺纖維化動(dòng)物模型。2.白三烯參與大鼠肺纖維化動(dòng)物模型形成過(guò)程中早期肺泡炎的產(chǎn)生和后期肺纖維化的形成。3.LTI可降低肺纖維化大鼠肺組織勻漿中羥脯氨酸的含量、降低大鼠肺纖維化模型肺組織的膠原代謝、減輕大鼠肺纖維化模型形成過(guò)程中早期肺泡炎和后期肺纖維化的程度。 第二章白三烯抑制劑對(duì)肺纖維化TH1/TH2類(lèi)細(xì)胞因子的作用 目的觀察TH1和TH2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4在博萊霉素所致大鼠肺纖維化形成過(guò)程中肺組織中的變化,探討LTI對(duì)IFN-γ和IL-4的影響,觀察LTI有無(wú)調(diào)節(jié)TH1/TH2細(xì)胞因子失衡作用。 方法博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型的制備和LTI的干預(yù)步驟和方法同第一部分。取C組、B組和T組大鼠右肺凍存于-70℃冰箱備用。檢測(cè)時(shí)取肺組織制成勻漿,低溫離心后取上清液按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明檢測(cè)肺組織Cys-LTs、LTB4、IL-4和INF-γ的濃度。 結(jié)果1.肺組織cys-LTs含量：B組與C組肺組織中Cys-LTs含量相比,各觀察時(shí)間點(diǎn)的含量均有增高(p值均0.001),以第7天含量最高,第28天含量最低；T組較B組含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)相比均有降低,第7天相比和第28天相比均有降低(p0.05),第14天相比有顯著降低(p0.025),但T組與C組含量相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)仍有顯著增高(第7天相比p0.001,第14天相比p0.005,第28天相比p0.05)。2.肺組織LTB4含量：B組含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)與C組含量相比均明顯增高(p0.001)；T組與B組相比,各觀察時(shí)間點(diǎn)的肺組織中LTB4含量均顯著降低,以第7天和第14天降低最顯著(p0.005),第28天相比也明顯降低(p0.025)；但T組與C組相比含量仍有增高,以第7天和第14天相比增高較顯著(p值均0.001),在第28天相比稍有增高(p值0.05)。3.肺組織INF-γ(Elisa結(jié)果)濃度：B組較C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均有降低,以第28天下降最明顯(p值均0.001)；T組較B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均有增高,以第7天和第28天時(shí)增高較為明顯(分別p0.005和p0.001),第14天相比稍有增高(p0.05)。但在各觀察時(shí)間點(diǎn)相比均仍高于C組,以第14天和第28天含量差異較為明顯(p0.005和p0.001)。4.肺組織IL-4(Elisa結(jié)果)濃度：B組第7天即開(kāi)始增高,至第28天含量最高,與C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均顯著增高(均p0.001)；T組與B組相比各觀察時(shí)間點(diǎn)含量均顯著降低(p0.005),但仍高于C組,以第14天(p0.005)和第28天較明顯(p0.001)。 結(jié)論 1.LTI可減少博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織勻漿中Cys-LTs、LTB4的含量。 2.LTI可增高博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織勻漿中TH1細(xì)胞因子INF-γ增高和TH2細(xì)胞因子IL-4。 3.LTI可-能通過(guò)調(diào)整TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡減輕肺纖維化早期肺泡炎的程度。 第三章LTI對(duì)肺纖維化時(shí)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads蛋白表達(dá)的影響 目的采用原位雜交技術(shù),觀察TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7在博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化,探討LTI對(duì)上述信號(hào)蛋白表達(dá)的影響。 方法博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型的制備和LTI的干預(yù)步驟和方法同第一部分。取C組、B組和T組大鼠左肺下葉組織制作臘塊并切片,采用鏈霉素親和素-過(guò)氧化物酶(SABC)法免疫組化染色檢測(cè)TGF-β的表達(dá),并采用DIG(地高辛)標(biāo)記的探針原位雜交法檢測(cè)肺組織中Smads的mRNA表達(dá)(參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行) 結(jié)果1.肺組織TGF-β1的表達(dá)結(jié)果：第7天、第14天和第28天的表達(dá)B組和T組均較C組明顯為強(qiáng)(p0.001),以第7天的表達(dá)最為明顯,且個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)T組均較B組為弱(p0.05)。2.肺組織中Smad2/3的表達(dá)：多在巨噬細(xì)胞、肺II型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)；C組動(dòng)物肺組織Smad3的表達(dá)在第7、第14和第28天三個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化；B組動(dòng)物與C組動(dòng)物相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)肺組織Smad3的表達(dá)均有增高,且在第7天即有增高(p0.005),第14天表達(dá)增高最明顯(p0.001)；T組較B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均有減低(p0.05),但仍高于C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)(均p0.05)。3.肺組織Smad4的表達(dá)：與Smad2/3的表達(dá)情況類(lèi)似,Smad4多表達(dá)在巨噬細(xì)胞、肺II型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)；B組在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯高于C組(P0.001),T組與B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯降低(p0.05),但仍顯著高于C組(P0.005)。4.肺組織Smad7的表達(dá)：與Smad2/3和Smad4的表達(dá)情況相反,多在巨噬細(xì)胞、肺II型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)；B組在各觀察時(shí)間點(diǎn)與C組相比均顯著低于C組(P0.001),第7天即減低,第14天表達(dá)最低,第28天又明顯增高；T組的表達(dá)在第7、14和28天均較B組的表達(dá)有所增高(均P0.05),然而在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)仍低于C組(P≤0.005)。 結(jié)論： 1.博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織內(nèi)TGF-β1的表達(dá)增強(qiáng),LTI可減低博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織TGF-β1的表達(dá)。 2.博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織的巨噬細(xì)胞、肺II型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)R-Smad(Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表達(dá)增強(qiáng)而細(xì)胞核內(nèi)I-Smad(Smad7)的表達(dá)減低,LTI可減低上述細(xì)胞胞漿內(nèi)R-Smad (Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表達(dá)增強(qiáng)并增強(qiáng)上述細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)I-Smad(Smad7)的表達(dá),減緩肺纖維化的形成。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R563

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2716478