【摘要】： 吸煙是呼吸系統(tǒng)疾病的重要危險(xiǎn)因素。香煙煙霧刺激正常人呼吸道上皮細(xì)胞,可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8, IL-8)的表達(dá)增加。IL-8基因順式調(diào)控元件內(nèi)有包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β(CCAAT/enhancer binding protein-β, C/EBPβ)在內(nèi)的多個(gè)核因子結(jié)合位點(diǎn)。但有關(guān)NF-κB和C/EBPβ在香煙煙霧誘導(dǎo)IL-8基因轉(zhuǎn)錄活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用尚不清楚。 目的 該研究用香煙煙霧凝集物(cigarette smoke extracts, CSE)刺激人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞,觀察CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損害作用和對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-8表達(dá)的影響。利用IL-8促進(jìn)子上的NF-κB, C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)突變細(xì)胞株(IL-8mNF-κB-BEAS-2B cells,IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B cells),細(xì)胞中被激活的NF-κB, C/EBPβ不能與IL-8促進(jìn)子結(jié)合。通過(guò)比較CSE刺激后,NF-κB, C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)突變BEAS-2B細(xì)胞與野生型BEAS-2B細(xì)胞(IL-8 WT BEAS-2B cells)中與IL-8促進(jìn)子相連的熒光素酶(luciferase,fLCF)基因表達(dá)量的變化,觀察NF-κB和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子在CSE引起的人支氣管上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)變化中的作用。為進(jìn)一步探討吸煙導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)炎癥發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1 CSE溶液的配制 CSE原液的制備參照Su Y的方法并改良,CSE原液用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋,配制好的CSE于30min之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。 2 MTT比色法測(cè)CSE溶液對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 用0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%的CSE溶液刺激BEAS-2B細(xì)胞,測(cè)定不同濃度的CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的抑制作用,并得出CSE溶液的半數(shù)抑制濃度。 3 CSE處理正常BEAS-2B細(xì)胞及IL-8基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)MTT測(cè)定的結(jié)果,分別以濃度0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的CSE作用正常BEAS-2B細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR,分析不同濃度CSE處理后細(xì)胞IL-8 mRNA水平的變化。 4 CSE處理3種突變型BEAS-2B細(xì)胞及其fLCF mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)CSE處理正常BEAS-2B細(xì)胞后IL-8基因表達(dá)的變化,用7.5%CSE作用3種突變型BEAS-2B細(xì)胞,通過(guò)熒光定量PCR,分析CSE處理后,細(xì)胞fLCF mRNA水平的變化。 5熒光素酶活性測(cè)定 以試劑盒中報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照,測(cè)定7.5%CSE作用的正常BEAS-2B細(xì)胞和3種突變型BEAS-2B細(xì)胞的熒光素酶活性。 結(jié)果 1 BEAS-2B細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 CSE刺激支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源的BEAS-2B細(xì)胞,可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)改變。CSE處理后,細(xì)胞胞漿疏松,漂浮細(xì)胞增多。隨著CSE濃度的增加,細(xì)胞受損情況也越嚴(yán)重。 2 7.5%CSE處理3種突變型BEAS-2B細(xì)胞,細(xì)胞綠色熒光的變化 3種突變型BEAS-2B細(xì)胞受到CSE作用后,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光細(xì)胞減少,細(xì)胞回縮變圓。 3 MTT檢測(cè)結(jié)果 CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,F=25.06,P0.001。且隨著藥物濃度的增加,CSE對(duì)細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為7.5%。 4 BEAS-2B細(xì)胞IL-8 mRNA在不同濃度CSE作用后的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 CSE作用BEAS-2B細(xì)胞,可導(dǎo)致其炎癥因子IL-8表達(dá)增加,單因素方差分析表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1808.1,P0.001)。低濃度(2.5%、5.0%和7.5%)的CSE刺激增加IL-8 mRNA的表達(dá)(P0.001),且具有濃度依賴性增高；但是10.0%CSE處理組大量細(xì)胞死亡,其IL-8 mRNA表達(dá)量與無(wú)CSE處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5 7.5%CSE作用3種突變型BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 7.5%CSE作用后,IL-8mNF-κB-BEAS-2B細(xì)胞和IL-8mC/EBPβ-BEAS-2B細(xì)胞的fLCF mRNA表達(dá)量都較IL-8 WT BEAS-2B細(xì)胞低,且IL-8 WT BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA表達(dá)量是IL-8mNF-κB- BEAS-2B細(xì)胞fLCF mRNA表達(dá)量的1.32倍,是IL-8mC/EBPβ- BEAS-2B細(xì)胞的fLCF mRNA表達(dá)量的1.54倍。 6熒光素酶活性測(cè)定 相同濃度和作用時(shí)間的CSE刺激,IL-8mNF-κB- BEAS-2B細(xì)胞和IL-8mC/EBPβ- BEAS-2B細(xì)胞的熒光素酶活性都較IL-8WT BEAS-2B細(xì)胞低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 結(jié)論 NF-κB轉(zhuǎn)錄因子參與CSE誘導(dǎo)的IL-8基因轉(zhuǎn)錄活化的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。該研究首次證實(shí)C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子參與CSE誘導(dǎo)的IL-8基因轉(zhuǎn)錄活化。提不NF-κB和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)參與炎癥因子IL-8表達(dá),促進(jìn)吸煙導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。 【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R562

【圖文】：

2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1香煙煙霧凝集物的制備csE的制備參照 suY17]的方法并改良。裝置如圖2.2所示，將1支去過(guò)濾嘴香煙(某品牌香煙，84mm長(zhǎng)，smm直徑，某香煙工業(yè)公司產(chǎn)，焦油含量 1sm歲支，煙堿含量1.2mg/支)連于一個(gè)抽吸裝置點(diǎn)燃，，每支煙吸smin，負(fù)壓吸引，一共抽吸2支香煙。吸入的煙霧經(jīng)過(guò)入口通入20ml無(wú)血清即Ml一1640培養(yǎng)液中制成懸液

BEAS一ZB細(xì)胞經(jīng)含0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%CSE的RPMI一1640培養(yǎng)24h后，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)BEAS一ZB細(xì)胞中，IL一 8mRNA的相對(duì)表達(dá)量。其擴(kuò)增曲線和熔解曲線，見(jiàn)圖3.4，圖3.5。從擴(kuò)增曲線和熔解曲線可知，各組基因的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性均達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。圖3.4不同濃度CSE作用BEAS一ZB細(xì)胞中IL一8和GAPDH擴(kuò)增曲線 Fig3.4AmPlifieationPlotsofIL一 8andGAPDHinBEAS一 Beells treatedbydiffereotconeentrationsofCSE

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏民巍;鄭賽晶;孟慶乃;金永明;周昆;胡利民;;中藥添加劑降低煙氣懸凝物誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞TNF-α、IL-8及氣道黏液蛋白基因mRNA高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

本文編號(hào)：2712467