發(fā)布時間：2020-06-07 14:07

【摘要】：目的:特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種常見的慢性、進行性和致死性的肺部疾病,其特征是纖維母細胞和成纖維細胞的異常增生和重構(gòu)。IPF的病因尚不明確,目前被廣泛接受的觀點是,特發(fā)性肺纖維化是由于受損的肺泡上皮細胞異常激活,引起成纖維細胞增生、纖維母細胞募集和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的沉積,損傷修復(fù)異常和肺部結(jié)構(gòu)重構(gòu)。針對IPF現(xiàn)階段尚無有效的治療手段,因此闡明其發(fā)生、發(fā)展過程對于IPF的預(yù)防和治療具有重要意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮細胞失去其表型轉(zhuǎn)而獲得間質(zhì)細胞表型的過程。該過程中伴隨著細胞極性的消失、胞間連接的解聚和細胞骨架的重排。在正常生理狀態(tài)下,EMT參與胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和組織重構(gòu)等一系列重要的生命進程。在病理條件下,EMT也可以被異常激活,增強細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,這點在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中尤為顯著。近期研究表明,IPF疾病進程中EMT扮演著重要的角色,受損肺泡上皮細胞EMT可能是間質(zhì)細胞的起源之一。內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是一種能夠識別并分揀泛素化蛋白的多亞基復(fù)合體。其成員包括:ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和Vps4-Vtal輔助因子家族,廣泛參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、自體內(nèi)吞、細胞自噬、胞膜損傷修復(fù)以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多細胞進程。CHMP3屬于ESCRT-Ⅲ家族成員,與其它三個核心亞基(Vps20、Snf7和Vps2)以及三個調(diào)節(jié)亞基(Did2、Vps60和Ist1)共同組成ESCRT-Ⅲ亞復(fù)合體,在多泡體(multivesicular body,MVB)生物合成中共同發(fā)揮作用。研究表明,ESCRT系統(tǒng)參與調(diào)控受體信號通路,維持上皮細胞極性,抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。這些現(xiàn)象與細胞EMT進程息息相關(guān),我們大膽推測ESCRT系統(tǒng)可能在肺泡上皮細胞EMT進程中扮演某種角色,并設(shè)計實驗進行驗證。本課題使用TGF-β誘導(dǎo)人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞的方法,構(gòu)建了肺泡上皮細胞EMT模型,檢測了E-cadherin、Vimentin和α-SMA在誘導(dǎo)前后表達量的變化,以及肺泡上皮細胞EMT進程中ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3的表達趨勢。分別采用多泡體生成抑制劑U18666A和構(gòu)建過表達CHMP3 A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的方法,初步探究了CHMP3對A549細胞EMT進程的影響及其潛在的分子機制。研究方法:1、本研究使用TGF-β誘導(dǎo)A549細胞構(gòu)建肺泡上皮細胞EMT模型。分別應(yīng)用倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細胞形態(tài)變化;Western Blot技術(shù)檢測誘導(dǎo)前后相關(guān)上皮分子標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達量的變化;免疫細胞熒光染色檢測誘導(dǎo)前后E-cadherin、Vimentin和α-SMA表達量的變化,評估造模效率。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測誘導(dǎo)前后CHMP3表達量的變化,觀察ESCRT系統(tǒng)在細胞EMT過程中的應(yīng)答。2、我們構(gòu)建了過表達CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,使用TGF-β分別誘導(dǎo)A549細胞和過表達CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組誘導(dǎo)前后E-cadherin和Vimentin表達量的變化,評估過表達CHMP3對肺泡上皮細胞EMT進程的影響。3、采用多泡體生成抑制劑U18666A干預(yù)A549細胞構(gòu)建ESCRT系統(tǒng)表達抑制模型。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測U18666A干預(yù)條件下ESCRT系統(tǒng)成員TSG101、CHMP1B、CHMP3和VPS4表達量的變化,評估干預(yù)效率。分別使用TGF-β誘導(dǎo)、U18666A干預(yù)和TGF-β/U18666A聯(lián)合誘導(dǎo)A549細胞,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組誘導(dǎo)前后E-cadherin和Vimentin表達量的變化,評估抑制ESCRT系統(tǒng)成員對于肺泡上皮細胞EMT進程的影響。結(jié)果:1、成功構(gòu)建肺泡上皮細胞EMT模型。TGF-β誘導(dǎo)組相較于對照組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,由原有的鵝卵石樣上皮細胞表型變?yōu)榧氶L梭樣間質(zhì)細胞表型。Western Blot結(jié)果顯示TGF-β誘導(dǎo)組E-cadherin表達增加,Vimentin表達減少。免疫熒光結(jié)果顯示,TGF-β誘導(dǎo)組E-cadherin和α-SMA表達增加,Vimentin表達減少。Western Blot結(jié)果顯示TGF-β誘導(dǎo)組ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3表達減少。2、成功構(gòu)建過表達CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)了外源CHMP3的表達。過表達CHMP3的A549細胞E-cadherin表達減少,Vimentin表達增加均弱于正常A549細胞。3、抑制劑U18666A干預(yù)后A549細胞ESCRT系統(tǒng)成員表達受到一定程度的抑制。Western Blot結(jié)果顯示CHMP3、CHMP1B和VPS4表達均減少但TSG101表達不變。U18666A誘導(dǎo)組E-cadherin表達下調(diào),Vimentin表達上調(diào),但變化趨勢沒有TGF-β誘導(dǎo)組顯著,TGF-β/U18666A聯(lián)合誘導(dǎo)組較之TGF-β誘導(dǎo)組亦未見顯著改變。結(jié)論:使用TGF-β誘導(dǎo)A549細胞成功構(gòu)建了肺泡上皮細胞EMT模型,在該進程中ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3表達減少。過表達CHMP3則可以抑制肺泡上皮細胞EMT進程。多泡體生成抑制劑U18666A可以下調(diào)CHMP3的表達,促進肺泡上皮細胞EMT進程。
【圖文】：

光學(xué)顯微鏡下觀察對照組和誘導(dǎo)組 A549 細胞形態(tài)變化3.1.2 免疫細胞熒光觀察 TGF-β 誘導(dǎo)前后，A549 細胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達變化情況

免疫細胞熒光觀察對照組和誘導(dǎo)組 A549 細胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達變化3.1.3 Western Blot 檢測 TGF-β誘導(dǎo)前后，A549 細胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達變化情況為了進一步驗證 TGF-β 誘導(dǎo) A549 細胞 EMT 模型構(gòu)建成功，我們對 10ng/mL
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563

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本文編號：2701533