【摘要】：目的:特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種常見(jiàn)的慢性、進(jìn)行性和致死性的肺部疾病,其特征是纖維母細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的異常增生和重構(gòu)。IPF的病因尚不明確,目前被廣泛接受的觀點(diǎn)是,特發(fā)性肺纖維化是由于受損的肺泡上皮細(xì)胞異常激活,引起成纖維細(xì)胞增生、纖維母細(xì)胞募集和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,損傷修復(fù)異常和肺部結(jié)構(gòu)重構(gòu)。針對(duì)IPF現(xiàn)階段尚無(wú)有效的治療手段,因此闡明其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程對(duì)于IPF的預(yù)防和治療具有重要意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮細(xì)胞失去其表型轉(zhuǎn)而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。該過(guò)程中伴隨著細(xì)胞極性的消失、胞間連接的解聚和細(xì)胞骨架的重排。在正常生理狀態(tài)下,EMT參與胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和組織重構(gòu)等一系列重要的生命進(jìn)程。在病理?xiàng)l件下,EMT也可以被異常激活,增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,這點(diǎn)在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中尤為顯著。近期研究表明,IPF疾病進(jìn)程中EMT扮演著重要的角色,受損肺泡上皮細(xì)胞EMT可能是間質(zhì)細(xì)胞的起源之一。內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)是一種能夠識(shí)別并分揀泛素化蛋白的多亞基復(fù)合體。其成員包括:ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和Vps4-Vtal輔助因子家族,廣泛參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、自體內(nèi)吞、細(xì)胞自噬、胞膜損傷修復(fù)以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多細(xì)胞進(jìn)程。CHMP3屬于ESCRT-Ⅲ家族成員,與其它三個(gè)核心亞基(Vps20、Snf7和Vps2)以及三個(gè)調(diào)節(jié)亞基(Did2、Vps60和Ist1)共同組成ESCRT-Ⅲ亞復(fù)合體,在多泡體(multivesicular body,MVB)生物合成中共同發(fā)揮作用。研究表明,ESCRT系統(tǒng)參與調(diào)控受體信號(hào)通路,維持上皮細(xì)胞極性,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這些現(xiàn)象與細(xì)胞EMT進(jìn)程息息相關(guān),我們大膽推測(cè)ESCRT系統(tǒng)可能在肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程中扮演某種角色,并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本課題使用TGF-β誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的方法,構(gòu)建了肺泡上皮細(xì)胞EMT模型,檢測(cè)了E-cadherin、Vimentin和α-SMA在誘導(dǎo)前后表達(dá)量的變化,以及肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程中ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3的表達(dá)趨勢(shì)。分別采用多泡體生成抑制劑U18666A和構(gòu)建過(guò)表達(dá)CHMP3 A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的方法,初步探究了CHMP3對(duì)A549細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響及其潛在的分子機(jī)制。研究方法:1、本研究使用TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞構(gòu)建肺泡上皮細(xì)胞EMT模型。分別應(yīng)用倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)變化;Western Blot技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后相關(guān)上皮分子標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)量的變化;免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)誘導(dǎo)前后E-cadherin、Vimentin和α-SMA表達(dá)量的變化,評(píng)估造模效率。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)前后CHMP3表達(dá)量的變化,觀察ESCRT系統(tǒng)在細(xì)胞EMT過(guò)程中的應(yīng)答。2、我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,使用TGF-β分別誘導(dǎo)A549細(xì)胞和過(guò)表達(dá)CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組誘導(dǎo)前后E-cadherin和Vimentin表達(dá)量的變化,評(píng)估過(guò)表達(dá)CHMP3對(duì)肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響。3、采用多泡體生成抑制劑U18666A干預(yù)A549細(xì)胞構(gòu)建ESCRT系統(tǒng)表達(dá)抑制模型。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)U18666A干預(yù)條件下ESCRT系統(tǒng)成員TSG101、CHMP1B、CHMP3和VPS4表達(dá)量的變化,評(píng)估干預(yù)效率。分別使用TGF-β誘導(dǎo)、U18666A干預(yù)和TGF-β/U18666A聯(lián)合誘導(dǎo)A549細(xì)胞,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組誘導(dǎo)前后E-cadherin和Vimentin表達(dá)量的變化,評(píng)估抑制ESCRT系統(tǒng)成員對(duì)于肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響。結(jié)果:1、成功構(gòu)建肺泡上皮細(xì)胞EMT模型。TGF-β誘導(dǎo)組相較于對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,由原有的鵝卵石樣上皮細(xì)胞表型變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭樣間質(zhì)細(xì)胞表型。Western Blot結(jié)果顯示TGF-β誘導(dǎo)組E-cadherin表達(dá)增加,Vimentin表達(dá)減少。免疫熒光結(jié)果顯示,TGF-β誘導(dǎo)組E-cadherin和α-SMA表達(dá)增加,Vimentin表達(dá)減少。Western Blot結(jié)果顯示TGF-β誘導(dǎo)組ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3表達(dá)減少。2、成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)CHMP3的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了外源CHMP3的表達(dá)。過(guò)表達(dá)CHMP3的A549細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少,Vimentin表達(dá)增加均弱于正常A549細(xì)胞。3、抑制劑U18666A干預(yù)后A549細(xì)胞ESCRT系統(tǒng)成員表達(dá)受到一定程度的抑制。Western Blot結(jié)果顯示CHMP3、CHMP1B和VPS4表達(dá)均減少但TSG101表達(dá)不變。U18666A誘導(dǎo)組E-cadherin表達(dá)下調(diào),Vimentin表達(dá)上調(diào),但變化趨勢(shì)沒(méi)有TGF-β誘導(dǎo)組顯著,TGF-β/U18666A聯(lián)合誘導(dǎo)組較之TGF-β誘導(dǎo)組亦未見(jiàn)顯著改變。結(jié)論:使用TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞成功構(gòu)建了肺泡上皮細(xì)胞EMT模型,在該進(jìn)程中ESCRT系統(tǒng)成員CHMP3表達(dá)減少。過(guò)表達(dá)CHMP3則可以抑制肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。多泡體生成抑制劑U18666A可以下調(diào)CHMP3的表達(dá),促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。
【圖文】：

光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組和誘導(dǎo)組 A549 細(xì)胞形態(tài)變化3.1.2 免疫細(xì)胞熒光觀察 TGF-β 誘導(dǎo)前后，A549 細(xì)胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達(dá)變化情況

免疫細(xì)胞熒光觀察對(duì)照組和誘導(dǎo)組 A549 細(xì)胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達(dá)變化3.1.3 Western Blot 檢測(cè) TGF-β誘導(dǎo)前后，A549 細(xì)胞上皮/間質(zhì)分子標(biāo)志物表達(dá)變化情況為了進(jìn)一步驗(yàn)證 TGF-β 誘導(dǎo) A549 細(xì)胞 EMT 模型構(gòu)建成功，我們對(duì) 10ng/mL
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R563

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